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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Preparación de las membranas cerebrales de los ratones
- Decapitar al ratón con un aparato de guillotina y diseccionar el cerebro rápidamente (en <1 min, si es posible, para minimizar los cambios de palmitoilación que pueden ocurrir durante el procedimiento de disección). Homogeneizar inmediatamente en 10 mL de tampón de homogeneización (Tabla 1) en un homogeneizador de vidrio (~12 golpes) sobre hielo.
- Centrifugar los lisados durante 15 min a 1.400 x g a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo en hielo. Vuelva a suspender el pellet (~ 6 golpes) en un volumen igual de tampón de homogeneización y centrífuga a 710 x g durante 10 min a 4 °C.
- Combine los sobrenadantes del paso 1.2 y centrifugue a 40.000 x g durante 20 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante (fracción citosólica) y vuelva a suspender la fracción de membrana peletizada (P2) en tampón de homogeneización.
NOTA: Las muestras pueden congelarse rápidamente y almacenarse a -80 °C para su uso posterior.
- Realice un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) para cuantificar los niveles de proteínas. Para el ensayo de cambio de gel de intercambio de acil-PEGilo (APEGS), comience con ~100-200 mg de proteína (máximo 250 mg) en un volumen de 470 μL de tampón A (Tabla 1) en un tubo de 1,5 mL. Sonicar y centrifugar a >13.000 x g durante 10 min a 25 °C para eliminar la proteína insoluble. Transfiera la proteína solubilizada a un nuevo tubo de 1,5 mL.
2. Ensayo de cambio de gel de intercambio de acil-PEGilo (APEGS)
- Rompe los enlaces disulfuro y bloquea las cisteínas libres.
- Interrumpir los enlaces disulfuro incubando en 25 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP; 25 μL, añadida a partir de una solución madre; Tabla 1) durante 60 min a 55 °C.
- Cisteínas libres en bloque con 50 mM de N-etilmaleimida (NEM; 12,5 μL, añadidas a partir de una solución madre; Tabla 1) a temperatura ambiente durante 3 h.
NOTA: La reacción puede extenderse durante toda la noche.
- Realizar la precipitación de metanol (CM) con cloroformo.
- Transfiera la solución de proteína de un tubo de 1,5 ml a un tubo de polipropileno o vidrio que se pueda centrifugar en un rotor de cubo oscilante a una velocidad modesta. Un tubo de 5 ml es ideal. Agregue cuatro volúmenes (2 mL) de metanol (MeOH) y vórtice brevemente.
- Agregue dos volúmenes (1 mL) de cloroformo y vórtice brevemente.
- Agregue tres volúmenes (1.5 mL) de agua desionizada (dH2O) y vórtice brevemente.
- Centrifugar las muestras a 3.000 x g durante 30 min a 25 °C en un rotor de cangilón oscilante.
- Retire con cuidado y deseche la fase superior.
- Agregue 3 volúmenes (1,5 ml) de MeOH y mezcle suave pero bien, teniendo cuidado de no fragmentar el panqueque proteico opaco.
- Centrífuga a 3.000 x g durante 10 min a 25 °C en un rotor de cangilón oscilante.
- Con una pipeta serológica de vidrio, retire la mayor cantidad posible de la fase superior sin alterar el panqueque proteico.
- Enjuague cuidadosamente el pellet con 1 mL de MeOH.
- Seque el pellet al aire durante al menos 10 min.
NOTA: El pellet seco se puede almacenar a -20 °C.
- Realizar la escisión de los enlaces palmitoil-tioéster con hidroxilamina (NH2OH, HAM).
- Vuelva a suspender el precipitado de proteína en 125 μL de tampón A y soniquelo brevemente. Centrifugar a >13.000 x g durante 10 min a 25 °C para eliminar el material insoluble. Transfiera la proteína solubilizada a un nuevo tubo de 1,5 mL.
- Añadir 375 μL de tampón H (HAM+; Tabla 1) o tampón T (HAM-; Tabla 1) e incubar muestras durante 60 min a 25 °C.
- Repita la precipitación de CM descrita en el paso 2.2.
NOTA: El pellet seco se puede almacenar a -20 °C.
- Agregue mPEG a las cisteínas no protegidas.
- Vuelva a suspender el pellet en 100 μL de tampón A que contenga 10 mM de TCEP. Transfiera a un tubo de 1,5 mL.
NOTA: Es normal que haya ocurrido una pérdida significativa de proteína durante los pasos de precipitación de CM. Todos los pasos posteriores se realizarán en un tubo de 1,5 mL, restringiendo el volumen de proteína a un máximo de ~120-130 μL. Esto reducirá la pérdida de proteínas durante la precipitación final de CM.
- Añadir 20 mM mPEG-5k (25 μL, añadidos de una solución madre; Tabla 1) para muestrear proteínas y mezclar por pipeteo. Incubar durante 60 min a 25 °C con rotación de extremo a extremo.
- Para eliminar el mPEG-5k no incorporado, realice la precipitación de CM como se describe en el paso 2.2 utilizando estos volúmenes ajustados: 4 volúmenes de MeOH (500 μL), 2 volúmenes de cloroformo (250 μL) y 3 volúmenes de dH2O (375 μL). Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25 °C.
- Retire con cuidado la fase superior como antes, evitando el panqueque espeso y floculante. Agregue 1 mL de MeOH y mezcle suave pero bien. Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25 °C.
- Retire con cuidado el sobrenadante y enjuague el pellet con 1 mL de MeOH. Centrifugar a >13.000 x g durante 10 min a 25 °C. Pellet de secado al aire.
NOTA: El pellet seco se puede almacenar a -20 °C.
- Vuelva a suspender el pellet seco en 50 μL de tampón A (sin TCEP ni ningún agente reductor).