Fabricación de microesferas de polímero liberadoras de beta-amiloide para modelar la enfermedad de Alzheimer

Resumen

Fuente: Almari, B., et al. Fabricación de microperlas de alginato secretoras de amiloide β para su uso en el modelado de la enfermedad de Alzheimer. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un método para fabricar microperlas de polímero que encapsulan células neurotóxicas secretoras de beta amiloide. La suspensión de célula y polímero se procesa a través de un dispositivo de fabricación de microperlas, con la gelificación del polímero lograda mediante reticulación de calcio, formando microperlas esféricas alrededor de las células. El polímero permite la proliferación celular a la vez que permite la liberación controlada y a largo plazo de beta amiloide, simulando su acumulación en la enfermedad de Alzheimer.

Protocolo

1. Preparativos

1. Prepare 100 mL de solución madre de alginato de ~4% (p/v).
   1. Pesar 4,4 g de sal sódica de alginato y añadir el polvo seco a 100 mL de solución salina tamponada con HEPES (HBS, 20 mM de hidroxietilpiperazina, etano sulfónico, ácido [HEPES] (0,477 g) con 150 mM de NaCl (0,877 g) en agua desionizada que permita la hidratación.
   2. Utilice un agitador magnético a ~500 revoluciones por minuto (rpm) y caliente hasta 50 °C para permitir una hidratación completa del alginato.
      nota: El alginato puede necesitar una o dos horas para estar completamente hidratado. Para ahorrar tiempo, la solución de alginato puede prepararse un día antes del protocolo de encapsulación y almacenarse a 4 °C hasta el día siguiente. Cuando el alginato se haya refrigerado, calentar suavemente a 37 °C utilizando un baño de agua o una placa calefactora y agitar con un agitador magnético inmediatamente antes de usar.
   3. Filtre estérilmente la solución de alginato con un filtro de polietersulfona (PES) de poro de 0,22 μm antes de usar. Se recomienda filtrar a 37 °C para permitir un fácil flujo de alginato. La viscosidad aumentará si se permite que la temperatura baje.
2. Prepare 1.000 mL de CaCl_{0,5 M 2}.
   1. Pesar 55,49 g de CaCl₂ anhidro y disolver en 1.000 mL de HBS (20 mM HEPES y 150 mM de NaCl en 1.000 mL de agua desionizada).
   2. Filtro estéril con un filtro PES de 0,22 μm de poros.
3. Prepare 100 mL de mezcla de disolución.
   1. Prepare una solución de 100 mM de HEPES (23,83 g) y 500 mM de citrato trisódico dihidratado (147,05 g) en solución salina tamponada con fosfato.
   2. Ajuste a pH 7.4 usando NaOH o HCl.

2. Configuración del sistema de encapsulación

1. Limpie la campana de flujo laminar.
   1. Esterilice la campana de flujo laminar que contiene el encapsulador mediante exposición a los rayos UV seguida de pulverización con una solución de etanol al 70% v/v.
   2. Enjuague el sistema encapsulador con 10 mL de solución de etanol al 70% v/v seguido de 10 mL de agua desionizada estéril.
   3. Coloque la boquilla de 300 μm y repita el paso 2.1.2.
   4. Rocíe el frasco que contiene la solución de alginato filtrada, el frasco que contiene la solución de cloruro de calcio filtrada y cualquier herramienta, equipo y placa de cultivo vacía que se utilizará con una solución de etanol al 70% v/v y colóquelos en la campana de flujo laminar. Antes de usar, vuelva a encender una luz ultravioleta durante 30 minutos para esterilizar a fondo.
   5. Prepare un vaso de precipitados lleno con una solución desinfectante de grado biológico y coloque el vaso de precipitados en la campana.
   6. Llene un vaso de precipitados con 100 ml de solución estéril de CaCl₂ (acuosa) y añada un agitador magnético. Ajuste la velocidad de agitación a 100 rpm. Coloque el vaso de precipitados en una plataforma magnética a una altura de 18 cm de la punta de la boquilla. Este vaso de precipitados se utilizará para recoger las perlas de alginato y permitir su gelificación.
2. Prepare las celdas para la encapsulación.
   1. Retirar las células de la incubadora y separarlas del matraz casi confluente con una solución de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25% e incubar a 37 °C durante 5-10 min.
   2. Aísle una muestra para estimar la densidad celular y luego centrifugue las celdas restantes a 1,000 rpm durante 5 min para obtener un pellet de celda.
   3. Vuelva a suspender el pellet en HBS (20 mM de HEPES y 150 mM de NaCl) para duplicar la concentración celular final deseada (por ejemplo, para una concentración final de 1,5 x 10⁶ células/mL, vuelva a suspender las células en HBS para lograr una concentración de 3 x 10⁶ células/mL).
   4. En un tubo de centrífuga de 50 mL, mezcle la suspensión celular en una proporción de 1:1 con una solución de alginato de ~4% (p/v) para obtener una suspensión final que contenga la concentración celular deseada (por ejemplo, 1,5 x 10⁶ células/mL) en una solución de alginato de ~2% (p/v).
3. Establezca los parámetros de encapsulación.
   1. Ajuste la velocidad de la máquina encapsuladora a la velocidad máxima de extrusión (8,9 mL/min), el voltaje a 1,0 kV y la frecuencia a 5.500 Hz.
      nota: Estos parámetros se optimizaron previamente para obtener microperlas de 550 μm de diámetro.

3. Fabricación

1. Fabrica las microperlas.
   1. En una jeringa de 20 ml, cargue 5 ml de la suspensión de alginato celular y conecte una jeringa al encapsulador.
   2. Inicie el encapsulador activando el flujo que empujará la suspensión de alginato celular a través del alimentador. Un chorro de gotas será extruida a través de la boquilla.
   3. Recoja el primer 1 ml en el vaso de precipitados para evitar el flujo inicial no uniforme.
   4. Continúe ejecutando los 4 mL restantes permitiendo que las gotas caigan en el baño de gelificación de CaCl₂. Cada mililitro se puede ejecutar por separado (pero sucesivamente) y recoger en cuatro baños de gelificación diferentes si es necesario.
      nota: Al entrar en contacto con el baño de gelificación, el alginato de las gotas se reticulará instantáneamente con los iones de calcio del baño de gelificación y formará microesferas esféricas.
   5. Después de un minuto, retire el vaso de precipitados de gelificación de la plataforma magnética y deje reposar las microperlas durante 4 minutos más sin agitación (tiempo necesario para permitir la gelificación completa a través de las microperlas a temperatura ambiente).
2. Recupera las microperlas.
   1. Retire cualquier residuo o artefacto de alginato grande con un par de pinzas estériles y, a continuación, utilice una pipeta de plástico estéril para transferirla a un filtro de malla de 74 μm para recuperar las microperlas del baño de gelificación.
   2. Transfiera las microperlas a un tubo de centrífuga utilizando el medio de cultivo adecuado y deje que se equilibren durante 5 minutos en el medio de cultivo celular.
   3. Transfiera a un matraz, placa o placa de Petri para la incubación y otros experimentos.
      nota: El baño de gelificación no debe reutilizarse.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.22 mmm filtro PSE	Merck, Reino Unido	SLGP033RS
Inserto de pozo de 15 mm 74 mmm filtro de malla	Constar, Estados Unidos	#3477
Ácido algínico sódico sal de algas pardas	Sigma-Aldrich,uk	A0682
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich,Reino Unido	C1016
CellTiter96 AQueous One Solution cell proliferation assay	Promega, Estados Unidos	G3580
Encapsulador	Inotech	IE-50	Nº de serie 05.002.01-2005
HEPES	Sigma-Aldrich,Reino Unido	H4024
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich,Reino Unido	D1408
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich,uk	433209
Citrato de trispdio dihidratado	Sigma-Aldrich,Reino Unido	W302600-K
Solución de tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich,Reino Unido	T4049