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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la revisión veterinaria de JoVE
Nota: Comience identificando la población murina objetivo. En estudios anteriores, solo se han utilizado ratones machos de tipo salvaje C57/Bl6. Sin embargo, también se pueden utilizar varios ratones transgénicos o knockout. Tenga en cuenta que las coordenadas estereotácticas se basan en la anatomía C57/Bl6. Se recomienda que cada usuario verifique inicialmente la localización del trazo en la materia blanca.
1. Inducción de Accidente Cerebrovascular de Materia Blanca - Abordaje Ángulo Medial
- Comience preparando una pipeta de vidrio estirado utilizando un tubo capilar de 0,5 mm con un diámetro distal entre 15-25 μm.
- Prepare una alícuota estéril de 10 μl de clorhidrato de L-Nio (N(5)-(1)-iminoetil-L-ornitina) a 27,4 mg/ml (130 μM) en solución salina normal estéril al 0,9%.
- Rellene previamente la pipeta de vidrio estirado con un pequeño volumen de L-Nio (2-5 μl) fijando la pipeta de vidrio a un tubo conectado a una línea de vacío. Coloque la pipeta plana sobre la mesa de trabajo e inserte el extremo tirado en la solución de L-Nio.
- Aplique el vacío hasta que se llenen al menos 2 mm de la porción de 0,5 mm de la pipeta. Apague la aspiradora y retire la pipeta. Colócalo a un lado hasta el Paso 1.12.
- Colocar al ratón en una cámara de inducción e inducir la anestesia del ratón utilizando isoflurano estándar al 32% fluido a través de un vaporizador (5 L/min inhalados con 5 L/min de oxígeno y 0,5 L/min de nitrógeno) durante 1 min o hasta que esté profundamente anestesiado. Transfiera el ratón a un aparato estereotáctico equipado con un microscopio estereotáctico. Proporcionar anestesia de mantenimiento utilizando isoflurano al 32% fluido a través de un vaporizador (2 L/min inhalados con 5 L/min de oxígeno y 0,5 L/min de nitrógeno) y un cono nasal. Verifique la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie.
- Ajuste el brazo de inyección a 36°.
- Fije un soporte de pipeta de vidrio estirado en el extremo distal de un sistema de inyección de presión de bajo volumen y conéctelo al brazo de inyección de la configuración estereotáctica.
- Cubra los bigotes del animal anestesiado con vaselina y coloque ungüento de lágrimas artificiales sobre ambos ojos. Prepare un campo quirúrgico estéril colocando un paño estéril sobre la cabeza del animal con una abertura de 5-10 cm sobre la cabeza. Prepare una superficie quirúrgica aséptica afeitando el pelaje que recubre el cráneo. Limpie el cuero cabelludo alternando betadine e hisopos con alcohol al 70%.
- Haga una incisión de 1,5 cm en la línea media del cuero cabelludo con tijeras finas estériles para exponer la superficie del cráneo. Seque el cráneo con un hisopo de algodón estéril y, utilizando un microscopio estereotáctico con un aumento de 1-3X, retire cualquier tejido perióstico suprayacente con una herramienta de micropuntos estéril.
- Marque el Bregma como punto de referencia con un marcador de punta fina.
- Taladre una craneotomía elíptica de 2 mm con una broca quirúrgica estéril de punta fina, comenzando posteriormente en el Bregma y extendiéndose anteriormente justo a la izquierda de la línea media. Retire los fragmentos óseos y el tejido blando suprayacente para que se pueda visualizar la corteza cerebral.
- Mantenga húmedos el campo quirúrgico y la superficie cortical mediante la aplicación intermitente de gotas de solución salina estéril.
- Fije una pipeta de vidrio estirada al brazo inyector del aparato estereotáctico. Alinee el extremo distal de la pipeta con el Bregma y ponga a cero las coordenadas estereotácticas.
- Avance la pipeta a las primeras coordenadas anterior/posterior (A/P) y medial/lateral (M/L) proporcionadas en la Tabla 1.
- Avance la pipeta hasta la superficie cortical y ponga a cero la medición dorsal/ventral (D/V).
- Pase lentamente la pipeta por el cerebro hasta alcanzar la primera coordenada D/V de la Tabla 1.
- Usando un sistema de inyección de presión de bajo volumen establecido en 20 psi para pulsos de 20 mseg, inyecte 100 nl de L-Nio en el cerebro y espere 5 min para evitar el reflujo por la pista de pipeta.
- Utilice una retícula calibrada en el ocular del microscopio estereotáctico y un aumento de 3X.
- En consecuencia, desplace un total de 0,100mm3 (0,5 mm de longitud en una pipeta de 0,5 mm de diámetro, lo que corresponde a 100 nl) de la pipeta de vidrio estirado para cada conjunto de coordenadas. Mediante el uso de una retícula, mida y estandarice, ya que cada configuración varía según el aumento y las escalas utilizadas.
- Para una medición precisa del volumen durante cada inyección, acerque la pipeta en ángulo con el microscopio desde un lado para que el menisco aire-líquido tenga una vista sagital. El menisco debe aparecer en el mismo plano focal de las paredes interna y externa de la pipeta.
- Retire lentamente la pipeta y repita los pasos 1.13 a 1.16.3 en el segundo y tercer conjunto de coordenadas proporcionadas en la Tabla 1.
- Después de la inyección final, retire la pipeta y coloque suficiente cera ósea para llenar el sitio de la craneotomía. Aproximar los bordes de la herida del cuero cabelludo y unirlos con adhesivo dérmico.
- Inyecte 0,1 ml de marcaína al 0,5% en los márgenes de la herida con una aguja estéril de 30 g para prevenir el dolor local asociado con la incisión del cuero cabelludo.
- Devolver el animal al establo y suministrar antibióticos postoperatorios (0,48 mg/ml de trimetoprim-sulfametoxazol o 0,5 mg/ml de levofloxacino) en el agua de bebida durante 5 días.
