1. Preparación de la pared corporal
NOTA: La preparación de las paredes corporales de las larvas del tercer estadio (para el estudio de los NMJs que inervan los músculos de la pared corporal) se realizó como se describió anteriormente, pero con algunas modificaciones.
- disección
- Aumentar las poblaciones de moscas y las cruzas a 25 °C durante cinco o seis días utilizando procedimientos estándar.
- Recoja las larvas rastreras del tercer estadio de los viales o frascos con pinzas finas.
- Lave las larvas en una pequeña placa de Petri que contenga solución salina tampón de fosfato (PBS) para eliminar cualquier partícula de comida.
- Coloque una sola larva en un disco de silgara y sumérjala en unas gotas de PBS helada. El uso de PBS helado ayudará a aturdir a la larva, lo que facilitará su manipulación. A lo largo de la disección, asegúrese de que la preparación esté siempre sumergida en PBS para evitar que se seque.
- Coloque la larva con la cara dorsal hacia arriba de modo que los dos tractos traqueales sean visibles bajo un microscopio de disección (Figura 1A). Usando las pinzas para agarrar un alfiler minucioso, sujete la larva en el extremo posterior cerca de los espiráculos (Figura 1B). Con otro alfiler, perfore la cutícula en el extremo anterior cerca de los ganchos bucales. Estire suavemente la larva a lo largo, luego sujétela con alfileres (Figura 1B).
- Con unas tijeras de microdisección, pellizca el extremo posterior cerca del alfiler para crear una pequeña abertura. La incisión debe ser lo suficientemente superficial como para pasar a través de la cutícula.
- Colocando la punta de la hoja inferior de las tijeras en la incisión, corte a lo largo de toda la línea media dorsal entre los dos tractos traqueales (Figura 1C). Apunte las hojas de la tijera ligeramente hacia arriba al cortar para evitar dañar los músculos de la pared ventral del cuerpo.
- Haga una pequeña incisión horizontal ligeramente anterior al clavo colocado posteriormente (Figura 1C). Realice otra incisión similar ligeramente posterior al clavo colocado anteriormente (Figura 1C). Las incisiones deben pasar a través de la cutícula.
nota: Las tres incisiones de los pasos 1.1.7 y 1.1.8 combinadas deben parecerse a un "
" cuando se completen, es decir, se debe producir un colgajo izquierdo y derecho en el lado dorsal del cuerpo larval.
- Limpie cuidadosamente los órganos internos con las pinzas. Agregar unas gotas contundentes de PBS ayudará a desplazar los órganos fuera del cuerpo de la larva, lo que facilitará su eliminación. Evite pinchar el cuerpo de la larva, ya que dañará los músculos de la pared del cuerpo.
- Despliega el cuerpo de la larva y sujeta las esquinas con alfileres (Figura 1D). Al sujetar, estire la pared del cuerpo tanto horizontal como verticalmente para formar un rectángulo tensado uniformemente (consulte la Figura 1G para ver la forma), teniendo cuidado de no desgarrar los músculos de la pared del cuerpo en el proceso.
- Termine de extraer los órganos internos restantes (Figura 1E).
- Fijación y permeabilización
- Sumerge las paredes del cuerpo clavadas en varias gotas de la Solución de Bouin. Incubar durante 15 min en hielo. Alternativamente, use paraformaldehído (PFA) al 4% como fijador alternativo; incubar durante 30 min.
- Enjuague tres veces con solución salina tampón de fosfato con Triton (PBT).
- Con pinzas finas, retire con cuidado los clavos y transfiera las paredes del cuerpo por sus esquinas a un tubo de microcentrífuga siliconado de 0,65 ml.
- Guarde las paredes de la carrocería en PBT a 4 °C hasta que esté listo para el PLA. Para obtener resultados óptimos, comience a inmunotinción las paredes del cuerpo dentro de uno o dos días después de la disección.
nota: Para ahorrar en reactivos y garantizar que todas las paredes del cuerpo se traten por igual durante el ensayo, se pueden colocar diferentes genotipos en un solo tubo. Los genotipos se pueden distinguir cortando las esquinas de las paredes del cuerpo de manera diferente (ver Figura 1F para ejemplo).
2. Inmunohistoquímica
NOTA: La inmunotinción de las paredes corporales de las larvas del tercer estadio se realizó como se describió anteriormente, pero con algunas modificaciones.
nota: Realice todos los pasos a temperatura ambiente y con agitación suave, a menos que se indique lo contrario.
- bloqueante
- Lave las paredes del cuerpo con PBT tres veces durante 10 minutos cada una.
- Bloquear con 1% de albúmina sérica bovina (BSA) durante 1 hora.
- Inmunotinción
- Incubar las paredes del cuerpo con anticuerpos primarios de ratón y conejo contra las dos proteínas de interés (diluidos en BSA al 1%) durante 2 horas a temperatura ambiente, o toda la noche a 4 °C. En este caso, use anti-Dlg de ratón 1:10 (Dlg = discos grandes) y anti-HtsM de conejo 1:250 (HtsM: Hu-li tai shao mutante). También se pueden incluir anticuerpos contra marcadores que no se producen en ratones o conejos, por ejemplo, use anti-Hrp de cabra 1:200 (Hrp = peroxidasa de rábano picante) para delinear las membranas neuronales.
- Lave con PBT tres veces durante 10 minutos cada una.
- Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos para detectar los marcadores (diluidos en BSA al 1%) durante 2 horas a temperatura ambiente, o toda la noche a 4 °C. A medida que la señal de PLA se visualiza posteriormente con un fluoróforo rojo, se debe usar otro fluoróforo para detectar el marcador, por ejemplo, use el anti-cabra conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) 1:200 para detectar el anticuerpo anti-Hrp de cabra. Debido al uso de reactivos sensibles a la luz, mantenga los tubos en la oscuridad a partir de este punto.
nota: El kit que se utiliza permite realizar PLA entre anticuerpos primarios criados en ratón y conejo, con la señal visualizada en el canal rojo bajo microscopía confocal. Si se desea, hay otros kits disponibles que permiten realizar el ensayo con anticuerpos primarios generados en otras especies y visualizar la señal en otros canales.
3. Ensayo de ligadura de proximidad
NOTA: Realice todos los pasos a temperatura ambiente y con agitación suave a menos que se indique lo contrario.
- Sondas PLA
- Lave las paredes del cuerpo con PBT tres veces durante 10 minutos cada una.
- Incubar con sondas de PLA (dilución 1:5 cada una en BSA al 1%) durante 2 horas a 37 °C. En este caso, utilice 40 μl de sonda de PLA anti-ratón MINUS, 40 μl de sonda de PLA anti-conejo PLUS y 120 μl de BSA al 1% para garantizar la inmersión y mezcla adecuadas de 5-10 paredes corporales. Una dilución de hasta 1:25 de las sondas PLA puede dar lugar a una relación señal-ruido adecuada (es decir, para este experimento).
- Ligadura
- Lave las paredes de la carrocería con Wash Buffer A dos veces durante 5 minutos cada una.
- Incubar con solución de ligadura (dilución 1:40 de ligasa en tampón de ligadura) durante 1 hora a 37 °C. En este caso, utilice 5 μl de ligasa, 40 μl de tampón de ligadura 5 y 155 μl de agua de alta pureza para garantizar la inmersión y mezcla adecuadas de 5-10 paredes corporales.
- amplificación
- Lave las paredes de la carrocería con Wash Buffer A dos veces durante 2 minutos cada una.
- Incubar con solución de amplificación (dilución 1:80 de la polimerasa en tampón de amplificación) durante 2 horas a 37 °C. En este caso, utilice 2,5 μl de polimerasa, 40 μl de tampón de amplificación 5 y 157,5 μl de agua de alta pureza para garantizar la inmersión y mezcla adecuadas de 5-10 paredes corporales.
- Preparación para la obtención de imágenes
- Lave las paredes de la carrocería con Wash Buffer B dos veces durante 10 minutos cada una.
- Lavar con 0.01x Wash Buffer B una vez durante 1 min.
- Equilibre con unas gotas de solución de montaje durante al menos 30 minutos antes del montaje, o almacene durante la noche a 4 °C.
- Con pinzas finas, transfiera con cuidado las paredes del cuerpo a un portaobjetos de plataforma con las cutículas hacia abajo. Coloque las paredes de la carrocería en filas y en la misma orientación dentro de una o dos gotas de montante. Coloque un cubreobjetos de 22 mm x 40 mm sobre la preparación teniendo cuidado de no generar burbujas de aire, luego selle el portaobjetos con esmalte de uñas transparente.
- Guarde los portaobjetos en la oscuridad a -20 °C hasta que estén listos para la obtención de imágenes confocal.
