Detección de interacciones proteína-proteína en larvas de Drosophila mediante un ensayo de ligadura de proximidad

Resumen

Fuente: Wang, S., et al. Detección de complejos proteína-proteína in situ en la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila mediante ensayo de ligadura de proximidad. J. Vis. Exp. (2015).

Este video demuestra la visualización de las interacciones proteína-proteína en la unión neuromuscular (NMJ) de Drosophila utilizando el Ensayo de Ligadura de Proximidad (PLA). Después de aislar las paredes del cuerpo, las proteínas que interactúan se prueban con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios conjugados con PLA. La proximidad de las proteínas que interactúan facilita la ligadura de las sondas con oligonucleótidos conectores, formando ADN circular, que luego se amplifica mediante amplificación en círculo rodante. Las sondas fluorescentes se unen al ADN amplificado, lo que permite la visualización de las interacciones proteína-proteína en el NMJ.

Protocolo

1. Preparación de la pared corporal

NOTA: La preparación de las paredes corporales de las larvas del tercer estadio (para el estudio de los NMJs que inervan los músculos de la pared corporal) se realizó como se describió anteriormente, pero con algunas modificaciones.

1. disección
   1. Aumentar las poblaciones de moscas y las cruzas a 25 °C durante cinco o seis días utilizando procedimientos estándar.
   2. Recoja las larvas rastreras del tercer estadio de los viales o frascos con pinzas finas.
   3. Lave las larvas en una pequeña placa de Petri que contenga solución salina tampón ....

Resultados

Figura 1: Preparación de las paredes del cuerpo de las larvas del tercer estadio. (De la A a la F) Dibujos esquemáticos que representan la disección de una pared corporal. (A) Coloque una sola larva en un disco de sílgara con su lado dorsal hacia arriba para que los dos tractos traqueales sean visibles. (B) Sujete la larva en los extremos anterior y posterior con alf.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinzas (multa #5)	Almédico	A10-704
Disco de Sylgard	Instrumentos de precisión mundiales	SYLG184	Mezcle la base de elastómero y el agente de curado en una proporción de 10:1. Duración de 30 min. Vierta en un molde (por ejemplo, use una placa de cultivo celular de 12 pocillos). Deje curar durante al menos 24 horas. Adherir a la tapa de una placa de Petri de 60x15 mm al diseccionar.
Pines minutientes (0,0125 mm de diámetro de punta)	Herramientas de Bellas Ciencias	26002-10
Tijeras de microdisección (ultra finas)	Herramientas de Bellas Ciencias	15200-00
Diapositivas de plataforma			Pegue dos cubreobjetos de 22x22 mm en un portaobjetos de microscopio con esmalte de uñas transparente, dejando un espacio de <20 mm entre ellos para el montaje de la muestra.
w1118	Centro de Stock de Drosophila de Bloomington	3605
HTS01103	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	10989	La culata se reequilibró sobre un equilibrador de GFP para que los mutantes homocigotos puedan seleccionarse en función de la ausencia de señal de GFP.
1x PBS (solución salina tamponada con fosfato): 3 mM de NaH2PO4, 7 mM de Na2HPO4, 130 mM de NaCl, pH 7,0			NaH2PO4 (Laboratorios Caledon - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
La solución de Bouin	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldehído): 4% PFA en 1x PBS			PFA (Ciencia de la Anaquimia - 66194-300). Véase doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 para instrucciones sobre cómo hacer la solución.
1x PBT (solución salina tamponada con fosfato con Triton): 1x PBS con 0.01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (Albúmina sérica bovina): 1% BSA en 1x PBT			BSA (Bioshop Canadá - ALB001). Almacenar a 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discos grandes)	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo	4F3	Úselo en una dilución de 1:10 en BSA al 1%.
conejo anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Proporcionado por la Dra. Lynn Cooley (Universidad de Yale). Úselo en una dilución de 1:250 en BSA al 1%.
conejo anti-Pak (quinasa activada por p21)			Proporcionado por el Dr. Nicholas Harden (Universidad Simon Fraser). Úselo en una dilución de 1:500 en BSA al 1%.
ratón anti-Wg (Sin alas)	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo	4D4	Úselo en una dilución 1:5 en BSA al 1%.
cabra anti-Hrp (Peroxidasa de rábano picante)	Jackson ImmunoResearch	123-065-021	Úselo en una dilución de 1:200 en BSA al 1%.
anti-cabra de burro conjugado con FITC	Jackson ImmunoResearch	705-095-003	Úselo en una dilución de 1:200 en BSA al 1%.
Duolink Sonda PLA In Situ anti-ratón MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink Sonda PLA In Situ anti-conejo PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Reactivos de detección in situ Duolink rojo	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Tampón de lavado A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Laboratorios Caledon - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Tampón de lavado B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Laboratorios Caledon - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x Tampón de lavado B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Laboratorios Caledon - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Medio de montaje in situ Duolink con DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040