Determinación de la capacidad de retención de calcio de mitocondrias aisladas

Resumen

Fuente: Li, W., et. al. Ensayo de capacidad de retención mitocondrial de Ca2+ y ensayo de hinchazón mitocondrial desencadenado por Ca2+. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra el procedimiento para evaluar la capacidad de retención de calcio mitocondrial mediante el monitoreo de cambios en tiempo real en la fluorescencia a medida que las mitocondrias absorben calcio. Este ensayo es útil para estudiar la función mitocondrial y los procesos relacionados con el calcio, incluida la apoptosis y las enfermedades neurodegenerativas.

Protocolo

1. Determinación de la capacidad de retención de Ca²⁺ mitocondrial

1. Prepare el medio KCl (125 mM de KCl (cloruro de potasio), 2 mM de K₂HPO₄ (fosfato dipotásico), 1 mM de MgCl₂ (cloruro de magnesio), 20 mM de HEPES (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazina-1-il]etanosulfónico), 5 mM de glutamato, 5 mM de malato y 2 μM de rotenona, pH 7,4) y añada el colorante verde fluorescente de unión a Ca²⁺ hasta una concentración final de 0,5 μM antes del experimento.
2. Transfiera 1 mL de mitocondrias aisladas (0,4 mg/mL) en un medio KCl que contenga 0,5 μM de tinte fluorescente verde de unión a Ca²⁺ en cada pocillo de placa de 6 pocillos.
3. Incubar las mitocondrias y el colorante verde fluorescente de unión a Ca²⁺ en la placa de 6 pocillos a temperatura ambiente, protegida de la luz ambiental durante 1 min. Agregue 4 μL alícuotas de una solución de 20 mM de CaCl₂ (cloruro de calcio) (20 mM de CaCl₂, 127 mM de KCl, 1 mM de MgCl_2, 20 mM de HEPES, 5 mM de glutamato, 5 mM de malato, pH 7,4) a cada pocillo de placa de 6 pocillos utilizando el ajuste de dispensación automática para introducir 200 nmol de Ca²⁺/mg de proteína mitocondrial.
4. Utilice un espectrómetro de fluorescencia para controlar los cambios de fluorescencia cada 3 s durante 2 minutos con una longitud de onda de excitación de 506 nm y una longitud de onda de emisión de 531 nm. La placa está equipada con agitación a 600 rpm durante 3 s entre lecturas controladas por software (Figura 1).
5. Agregue 4 μL adicionales de alícuota de 20 mM de solución de CaCl₂ a cada pocillo y controle los cambios de fluorescencia cada 3 s durante 2 min. Repita este paso hasta que la fluorescencia aumente con el tiempo.
   nota: Las mitocondrias se ven desafiadas con el Ca²⁺ añadido indicado por el aumento de la fluorescencia de registro. Cuando se abre el mPTP (poro de transición de permeabilidad mitocondrial), la fluorescencia aumenta con el tiempo.
6. Interprete la cantidad total de Ca²⁺ añadida hasta que se abra el mPTP como la capacidad de retención de Ca²⁺.

Resultados

Figura 1: Configuración del software para el ensayo de capacidad de retención de Ca²⁺.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Calcio verde-5N	Tecnologías de la vida	c-3737	Colorante fluorescente verde fijador de calcio
Glutamato	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
Malato	Sigma-Aldrich	46940-U
Rotenona	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	457
Fosfato dipotásico	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	V900266