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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de sistemas de infusión con bomba microosmótica
NOTA: Prepare la bomba, el tampón de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) y el fármaco (solución de proteína Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL en aCSF)) en condiciones estériles utilizando tampones filtrados con filtros de 0,2 μm y realice todos los procedimientos bajo la cubierta de cultivo con guantes. Los procedimientos quirúrgicos se llevan a cabo de la siguiente manera:
- Prepare las bombas microosmóticas un día antes de la cirugía: Llene la bomba microosmótica cerebral con líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) con una jeringa de 1 ml y una aguja de punta roma junto con el kit. Sumerja la bomba microosmótica en aCSF y colóquela en un agitador agitando suavemente durante la noche.
PRECAUCIÓN: La bomba debe llenarse con aCSF y se deben evitar las burbujas de aire dentro de la bomba (Figura 1A).
- Antes de comenzar la cirugía, prepare la solución de proteína recombinante Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL, diluida en aCSF) para el experimento. Retire el líquido cefalorraquídeo de la bomba y llénela lentamente con la solución del medicamento hasta que se filtre el exceso.
NOTA: 15 mL de solución aCSF o Met-CCL5/RANTES es suficiente para 5-8 bombas.
PRECAUCIÓN: Repita el procedimiento para asegurarse de que la bomba esté completamente llena con el medicamento sin burbujas en su interior.
- Corte los tubos del catéter a la longitud deseada y conéctelos a la aguja de infusión cerebral de extremo romo del kit de infusión cerebral. Llene el kit de infusión y los tubos con el medicamento.
- Finalmente, ensamble y conecte el kit de infusión cerebral a la bomba microosmótica.
PRECAUCIÓN: No se deben formar burbujas en el tubo ni en la bomba (Figura 1A).
- Sumerja todo el conjunto de fusión entre la bomba osmótica y el cerebro en aCSF en un tubo esterilizado de 50 ml para evitar que la bomba se seque. El set de fusión de bomba osmótica y cerebro ya está listo para ser utilizado para la cirugía.
NOTA: Los sistemas de bombas microosmóticas se pueden utilizar para la infusión de fármacos a largo plazo. Esto garantiza un modo seguro y conveniente de administración de fármacos en el cerebro del ratón.
2. Cirugía ventricular intracerebral: implantación de la bomba microosmótica
PRECAUCIÓN: Esterilice el ambiente quirúrgico con etanol al 75% y asegúrese de que las personas involucradas en el estudio usen guantes estériles y una bata de laboratorio limpia. Las herramientas quirúrgicas deben esterilizarse en autoclave y secarse antes de su uso y posteriormente esterilizarse con etanol al 75% entre cirugías con ratones.
- Pesar el ratón y anestesiarlo mediante inyección intraperitoneal (IP) con Ketamina/Xilacina (Ketamina 50 mg/kg, Xilacina 10 mg/kg).
PRECAUCIÓN: Los ratones con un peso corporal inferior a 24 g no se recomiendan para la cirugía de implantación de bomba osmótica.
- Monte y fije la cabeza del ratón en el aparato estereotáctico (Figura 1B).
- Use un par de tijeras quirúrgicas y pinzas para abrir la piel exterior que cubre el cráneo. Use yodo para limpiar el cráneo periférico.
- Separe la capa más externa de la piel subcutánea con la ayuda de un par de pinzas de cabeza roma cerca de la región del cuello para la implantación del equipo de fusión cerebro-bomba osmótica (Figura 1C).
- Marque el punto de infusión con referencia al mapa cerebral (Figura 1D) utilizando el aparato estereotáctico. En este experimento, la aguja debe implantarse en la3ª región del ventrículo (Bregma: 0,0 mm lateral, 1,3 mm posterior, 5,7 mm ventral).
- Taladre un agujero con un taladro de clavos alrededor del área marcada en el cráneo (Figura 1E).
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no romper las meninges y los vasos sanguíneos del ratón, evitando así la interrupción de los microvasos sanguíneos en el cerebro.
- Coloque el equipo de fusión microosmótica bomba-cerebro que contiene aCSF (como control) o fármaco (solución de proteína Met-CCL5/RANTES) debajo de la piel detrás de la región del cuello e inserte la aguja de infusión cerebral en el orificio perforado para infundir el fármaco en el cerebro del ratón (Figura 1E). La aguja penetrará en las meninges y penetrará en el ventrículo. Fije la aguja en su lugar en el cráneo con un gel desensibilizante de superficie (Figura 1F) y espere de 1 a 2 minutos hasta que el pegamento se seque. A continuación, corte la parte saliente en la parte superior de la aguja (Figura 1G-H).
- Use un pegamento adhesivo de papel tisú para curar la herida de la operación en la cabeza. Aplique 50 μL del pegamento sobre la herida, junte ambos lados de la piel y manténgala durante 30 segundos para permitir que la piel se selle (Figura 1I).
PRECAUCIÓN: Use una almohadilla con alcohol 100% para limpiar la herida después de la cirugía y 100 ul de penicilina con estreptomicina para prevenir la infección. nota: La piel del ratón formará tejido cicatricial y sanará en unos días después de la administración del pegamento quirúrgico. La principal ventaja del pegamento es que evita los puntos quirúrgicos, que pueden causar irritación o inflamación de la piel.
- Coloque el ratón en una jaula limpia mantenida sobre una placa caliente (calentada hasta 37 °C) y espere hasta que el ratón se recupere del efecto anestésico.
PRECAUCIÓN: Es fundamental mantener la temperatura corporal del ratón para aumentar las posibilidades de supervivencia después de la cirugía.
- Después de un período de recuperación de una semana, los ratones estarán listos para otros experimentos, como la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) y la prueba de tolerancia a la insulina (ITT).
3. Prueba de Tolerancia Oral a la Glucosa (OGTT)
NOTA: Realice la prueba de tolerancia oral a la glucosa 7 días después de la infusión de aCSF y MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 μL). Mantenga un ayuno de 6 horas para los ratones antes de la OGTT con suficiente suministro de agua. Mantenga a los animales en el mismo banco de trabajo donde se realizarán los experimentos para que puedan aclimatarse al entorno y reducir el estrés durante el procedimiento.
- Preparación de la solución de glucosa: Antes de realizar el experimento, prepare la solución de glucosa disolviendo 3,75 g de glucosa en 15 mL de H2O destilado.
- Establezca un horario para registrar las lecturas durante el procedimiento experimental (Tabla 1).
NOTA: Es importante establecer un horario con intervalos adecuados entre cada examen de sangre para permitir un registro preciso durante el experimento.
- Pesar cada ratón después del ayuno y calcular la cantidad adecuada de glucosa que se va a inyectar. Por ejemplo, si el ratón pesa 30 g, la cantidad de solución de glucosa que se debe administrar debe ser de 300 μL.
- Prepare los siguientes instrumentos en el banco de trabajo:
- Glucómetro (Presione el botón de inicio para verificar el estado de la batería; asegúrese de que esté funcionando antes de la prueba).
- Chip de glucosa
- Jeringa de insulina (jeringa de insulina de 0,3 ml)
- Afeitar
- temporizador
- Una vez que el banco esté configurado, mida y registre el nivel de glucosa en sangre de la siguiente manera: Coloque un chip de glucosa limpio y nuevo en el glucómetro y presione el botón de inicio para ponerlo a cero.
- Levante al ratón por la parte posterior del cuello y acaricie la cola varias veces para asegurarse de que haya suficiente flujo sanguíneo a la región de la cola.
- Usar una nueva cuchilla de afeitar para cortar un pequeño trozo de la cola y exprimir una pequeña gota de sangre (alrededor de 10-20 μL) en el chip de glucosa. La sangre debe llenar el chip para permitir una medición precisa. El glucómetro mostrará el nivel de glucosa inmediatamente. Si la máquina muestra un "error", repita el procedimiento con un nuevo chip de glucosa.
NOTA: El chip de glucosa requiere solo una gota de sangre. Cuando sea necesario recoger la muestra de sangre más de una vez, basta con aplicar presión pasando los dedos por la cola del ratón varias veces mientras se sostiene el extremo de la cola directamente sobre el chip para recoger la sangre. No es necesario cortar el extremo de la cola cada vez que se recolectan muestras de sangre.
- A continuación, alimente a los ratones con glucosa (0,25 g/mL) por vía oral mediante la técnica de sonda nasogástrica intragástrica. La cantidad de glucosa a administrar debe calcularse utilizando la fórmula: 10X peso corporal (PC) μL de solución de glucosa (por ejemplo, si el ratón pesa 30 g, la cantidad de solución de glucosa a administrar será de 300 μL). Inicie el temporizador inmediatamente después de administrar glucosa oral.
- Repita el procedimiento de medición de glucosa a los 15, 30, 60, 90 y 120 minutos.
- Después de que se hayan registrado todas las lecturas del nivel de glucosa, deseche las hojas de afeitar y los chips de glucosa en un recipiente de riesgo biológico. Vuelva a colocar la comida en las jaulas de los ratones y devuélvalos a la habitación de los animales.
Tabla 1. Horario para el registro de la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT)
| # | ID del ratón | cuerpo | glucosa | empezar | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| | peso | μL =10xBW | Hora | Minutos | Minutos | Minutos | Minutos | Minutos |
| 1 | 501 | 25,8 g | Artículo 258 | 9:00 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 |
| número arábigo | 502 | 25,3 g | Artículo 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 |
