Inducción experimental de glaucoma a través de la obstrucción del ángulo iridocorneal en un modelo de ratón

Resumen

Fuente: Bunker, S., et al. Glaucoma experimental inducido por inyección ocular de microesferas magnéticas. J. Vis. Exp. (2015)

En este video, una rata anestesiada se somete a un procedimiento ocular en el que se inyectan perlas magnéticas en la cámara anterior bajo un campo magnético para bloquear el ángulo iridocorneal. Esta obstrucción obstruye la malla trabecular, impidiendo el drenaje acuoso del humor y provocando un aumento de la presión intraocular, dañando las células ganglionares de la retina y el nervio óptico. Esto desarrolla una afección similar al glaucoma.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Inducción de la hipertensión ocular

1. Inducir glaucoma experimental mediante la elevación de la presión intraocular (PIO) mediante la inyección unilateral de microesferas paramagnéticas en la cámara anterior de ratas marrones noruegas. Otras ratas pigmentadas pueden ser adecuadas, aunque el usuario tendría que validarlas primero.
2. Aloje ratas noruegas marrones ex-reproductoras de 250-300 g en un entorno de poca luz constante (40-60 lux) para minimizar las fluctuaciones diurnas en la PIO, con acceso a alimentos y agua.
3. Realice mediciones basales de la PIO en animales despiertos8 antes de la anestesia y la inyección de perlas, utilizando un tonómetro de rebote calibrado para su uso en el ojo de rata9. La PIO se toma como la media de cinco lecturas.
4. Anestesiar ratas con 37,5 mg/kg de ketamina y 0,25 mg/kg de clorhidrato de medetomidina administrado por vía intraperitoneal. Confirme la profundidad de la anestesia probando los reflejos de la pata trasera del animal antes de la aplicación de povidona yodada (ver paso 1.5) y la inyección de perlas (ver paso 1.8). Administrar clorhidrato de proparacaína al 0,5% para la analgesia.
   NOTA: No dilatar la pupila en ningún momento. Esto ayudará a que las perlas se asienten mejor en el ángulo iridocorneal y evitará que se unan al cristalino. Aplique ungüento ocular para prevenir la sequedad de la córnea en el ojo contralateral no operado.
5. Lave el ojo operatorio con povidona yodada al 5% en agua 5 minutos antes de la inyección.
6. Después de 5 minutos, absorba la povidona yodada con una gasa estéril y lave el ojo con una solución salina estéril al 0,9%. Mantenga el ojo húmedo durante la anestesia con la aplicación regular de solución salina estéril.
7. Coloque un imán toroidal alrededor del ojo.
8. Inyecte 25 μl de una solución que contenga 30 mg/ml de microesferas magnéticas esterilizadas de 8 μm con irradiación gamma en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en la cámara anterior utilizando una aguja biselada de 33 g.
   1. Para preparar las perlas, lavar volviendo a suspender, luego centrifugar 3 veces a 10,000 x g durante 5 min con 1 ml de HBSS antes de hacer la solución final de 30 mg/ml. Mantenga las condiciones estériles en todo momento.
   2. Para la inyección, tenga cuidado de evitar insertar la aguja en el iris, para minimizar el riesgo de traumatismo del iris. Esto se puede prevenir orientando la aguja tangencial a la superficie de la córnea, lo más paralela posible al iris. Esto también ayudará a minimizar la pérdida de cordones desde el lugar de inyección.
      NOTA: Inyecte las perlas a un ritmo rápido para asegurar una distribución uniforme alrededor del ángulo iridocorneal, que es fundamental para aumentar la PIO. Además, guarde las cuentas, las agujas y los anillos magnéticos por separado para que las cuentas no formen grupos, lo que dificulte su carga en la jeringa y la inyección, y la aguja no se magnetice.
9. Deje la aguja en su lugar durante 1 minuto después de la inyección para asegurarse de que las perlas se asienten en el ángulo iridocorneal para impedir el drenaje acuoso de la malla trabecular. Incline ligeramente la aguja después de que las perlas se hayan asentado inicialmente para permitir algunas fugas de líquido acuoso, para minimizar los aumentos transitorios de la PIO. Al final de la cirugía, enjuague la aguja primero con solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego etanol al 70%, seguido de agua destilada, para garantizar el uso continuo de la aguja en procedimientos separados. Alternativamente, se pueden usar agujas desechables si se dispone de la combinación correcta de calibre y jeringa. Opcional: las agujas se pueden afilar con un biselador para prolongar su uso.
10. En esta etapa, si es necesario, retire el imán y utilícelo para atraer cuentas en áreas de cobertura incompleta.
11. Deje el imán en su lugar alrededor del ojo durante 10 minutos más después de la inyección para asegurarse de que las perlas se asienten bien en el ángulo iridocorneal.
12. Anestesia inversa con 0,25 mg/kg de clorhidrato de atipemezol.
13. Administre cloranfenicol u otra pomada antibiótica, por ejemplo, gentamicina o terramicina por vía tópica para prevenir la infección, y clorhidrato de proparacaína al 0,5% para la analgesia. Deje que los animales se recuperen en una estera térmica hasta que recuperen el movimiento, luego transfiéralos a una caja caliente y bríndeles nutrición adicional, como un suplemento alimenticio o una dieta regular humedecida, hasta que se complete la recuperación. Se debe administrar analgesia sistémica o local a los animales que muestren signos de dolor 24 horas después de la cirugía. Si estos síntomas persisten a pesar del tratamiento, los animales deben ser sacrificados de manera humanitaria.
14. Utilice el ojo contralateral como un control no operado.
15. Tome medidas de PIO cada 2-3 días después de la administración de perlas y cada 2-3 días a partir de entonces utilizando un tonómetro de rebote calibrado para su uso en el ojo de rata.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
250-300g ratas hembras marrones noruegas ex-reproductoras	Harlan Reino Unido	203
Tonómetro de rebote Tonolab	Tiolat	TV02
Ketaset (Ketamina)	Fort Dodge Salud animal	BN1000118	37.5 mg/kg
Domitor (clorhidrato de medetomidina)	Orion Pharma	140-999	0.25 mg/kg
Povidona yodada	Ecolab	BN4369LE10	5% en H2O
Solución salina de Minim	Bausch y Lomb	PL00033/5017
Imán toroidal	Supermagnete	R-10-07-03-N
Microesferas magnéticas	Laboratorios Bangs	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
Aguja biselada de calibre 33	Hamilton	7747-01	Aguja personalizada
Jeringa de punta Luer	Hamilton	80601
Antisedán (clorhidrato de atipemezol) )	Orion Pharma	141-003	0.25 mg/kg
Ungüento de cloranfenicol	Medicom	18956-0005