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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Preparación de portaobjetos y tejidos
- Utilice portaobjetos de silano o portaobjetos de vidrio de membrana de naftalato de polietileno (PEN).
- Para el aislamiento de ARN, sumerja los portaobjetos en una solución de descontaminación de ARNasa, lávelos 3 veces con agua sin ARNasa, luego deshidrételos con una serie graduada de etanol sin ARNasa y séquelos al vacío durante 30 min.
- Corte secciones de tejido de 10 μm de espesor con un criostato y móntelo en los portaobjetos sin ARNasa preparados. Mantenga las secciones congeladas durante el corte para preservar la calidad del ARN. NOTA: Asegúrese de que el tejido esté aproximadamente a 4 mm de distancia de los bordes del portaobjetos, ya que el LCM no puede eliminar el tejido que esté demasiado cerca de los bordes del portaobjetos. Para eliminar el tejido de un portaobjetos de membrana PEN, asegúrese de que el tejido esté a 4 mm de la izquierda, la parte superior e inferior y a 7 mm del lado derecho del portaobjetos, que son las dimensiones de la membrana que no está unida al portaobjetos.
- Para el aislamiento de poblaciones celulares individuales mediante inmunohistoquímica directa, corte el tejido en los portaobjetos de preparación de silano o en los portaobjetos de membrana PEN. Para el aislamiento de regiones de tejido mediante técnicas guiadas por inmunohistoquímica indirecta, monte un conjunto de secciones en un portaobjetos de preparación con silano para la inmunohistoquímica y secciones alternas en un portaobjetos de membrana PEN y/o un portaobjetos de preparación con silano para el LCM.
2. Preparación de tejidos para la captura con láser: inmunohistoquímica rápida de tirosina hidroxilasa para la captura directa con láser de células inmunorreactivas
- Delinee el tejido con un bolígrafo hidrofóbico y déjelo secar.
- Fije el tejido en una solución de acetona-metanol (1:1) a -20 °C durante 10 min. NOTA: Nuestra experiencia ha demostrado que la fijación de acetona-metanol resultó en una inmunohistoquímica mucho más consistente que la acetona o el metanol solos.
- Portaobjetos de enjuague en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Triton al 1% (sin RNasa).
- Cubrir secciones con 100-200 μl de PBS con Triton al 1% con anticuerpo de tirosina hidroxilasa diluido 1:100 con 400 U/ml de RNasin. Incubar durante 5-10 min.
- Enjuague brevemente en PBS dos veces y PBS-1% Triton.
- Cubrir el tejido con 100-200 μl de IgG anti-conejo de cabra marcada con Alexa Fluor 488 diluida 1:100 en PBS-1% Triton con 400 U/ml de RNasin y 50 ng/ml de DAPI. Incubar durante 5 min.
- Enjuague 2 veces en PBS y luego deshidrate 30 s en una serie graduada de etanol libre de RNasa (75%-75%-95%-95%-100%-100%).
- Incubar en dos lavados de xileno durante 1 minuto y luego 5 minutos.
- Retire los portaobjetos del xileno inmediatamente antes de usarlos para LCM y déjelos secar al aire.