Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila

Resumen

Fuente: Wagner, K. et al., Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP. J. Vis. Exp. (2022).

Este video muestra la visualización del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas TRPL marcadas con eGFP. En él se detalla la preparación de moscas transgénicas para la obtención de imágenes, la captura de imágenes de fluorescencia de células fotorreceptoras y la cuantificación del tráfico de TRPL mediante la medición de la fluorescencia relativa de eGFP en los rabdómeros.

Protocolo

1. Consideraciones generales

1. Utilice las existencias de Drosophila que expresan proteínas translocadas permanentemente radicadas rabdomeralmente para análisis relacionados con el tráfico de proteínas (por ejemplo, canal iónico de espectro similar al receptor transitorio (TRPL):: proteína fluorescente verde mejorada (eGFP), Arrestina 2 ( Arr2)::eGFP).
2. Predetermine las condiciones de exposición a la luz de las moscas seleccionadas para el enfoque experimental.
   1. Para la adaptación a la oscuridad, mantenga las moscas en cajas oscuras durante el período deseado a 25 °C. Para una iluminación de hasta 16 h en experimentos de translocación (por ejemplo, moscas que expresan TRPL::eGFP), mantenga las moscas bajo un tubo fluorescente a temperatura ambiente.
   2. Para iluminar moscas con luz de color, use cajas de plástico transparente de diferentes colores junto con el tubo fluorescente.

2. Microscopía

1. de inmersión en aguaFly preparation
   1. Prepare el espacio de trabajo con el equipo y los reactivos necesarios, como se muestra en la Figura 1. Transfiera las moscas con edad e iluminación predeterminadas a un tubo de centrífuga preenfriado de 15 ml y anestesia incubándolas en hielo durante 15 a 30 minutos.
      NOTA: Lleve consigo moscas de 1 día de edad, adaptadas a la oscuridad, como referencia. Por lo general, las moscas adaptadas a la oscuridad deben transferirse a una nevera con tapa en la oscuridad. Las moscas adaptadas a la luz se pueden transferir al hielo a la luz de la habitación.
   2. Transfiera una mosca anestesiada con hielo de cabeza a una punta de pipeta de 200 μL y empuje la mosca hacia la punta con cuidado con aire comprimido.
   3. Corta la punta de la pipeta justo delante de la cabeza con un bisturí. Con unas pinzas, empuje con cuidado la mosca a unos milímetros de la punta. Vuelva a cortar la punta de la pipeta y empuje la mosca hacia la punta con aire comprimido para que solo la cabeza de la mosca sobresalga de la punta de la pipeta.
   4. Adhiera un trozo de plastilina en un objeto, deslice y presione la punta de la pipeta en él de modo que el ojo izquierdo o derecho de la mosca mire hacia arriba (Figura 2A). Justo antes de la adquisición de la imagen, utilice una pipeta de laboratorio para adherir una gota grande de agua fría a la parte inferior de un objetivo de inmersión en agua (Figura 2B). Proceda inmediatamente a la adquisición de imágenes para obtener mejores resultados.
      NOTA: Un retraso significativo en la adquisición de imágenes resulta en el despertar y movimientos de la mosca que pueden llevar a imágenes borrosas.
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2. span style='background-color:transparent;color:#000000;'>Image acquisition
   1. Coloque cuidadosamente el portaobjetos con la mosca preparada en la platina del microscopio y seleccione un objetivo de inmersión en agua.
   2. Baje el objetivo de inmersión en agua manualmente hasta que el ojo de la mosca toque la gota (Figura 3A, B).
   3. Encienda la lámpara UV del microscopio y seleccione el conjunto de filtros apropiado. Utilice los oculares para colocar la mosca debajo del objetivo y enfocar el microscopio en la superficie del ojo.
   4. Cambia la trayectoria de la luz hacia la cámara del microscopio y genera una imagen en vivo en el software correspondiente. Vuelva a ajustar el enfoque de la cámara y evalúe la orientación del ojo, teniendo en cuenta que el ojo tiene que mirar radialmente hacia el objetivo del microscopio, como se ilustra con más detalle en la Figura 3C-E.
   5. Utilice la LUT (tabla de búsqueda) apropiada dentro del software de imagen para detectar la sobresaturación (indicada como píxeles rojos).
   6. En el caso de moscas no pigmentadas, ajusta el tiempo de exposición de manera que los píxeles más brillantes estén justo por debajo del límite de saturación para cada imagen.
   7. Graba una imagen y guárdala como un archivo sin procesar para archivar todos los metadatos correspondientes de la grabación. Exporte la imagen en un formato .tif para la siguiente cuantificación.
      NOTA: Ilumine las moscas durante 5 minutos con luz roja (por ejemplo, 630 nm) inmediatamente después de la adquisición de la imagen, si están destinadas a ser utilizadas para experimentos adicionales. La luz roja desactiva la cascada de fototransducción que ha sido activada excesivamente por la luz intensa de onda corta durante la adquisición de la imagen.
      
3. Análisis de datos y cuantificación de la fluorescencia relativa de eGFP en los rabdomeros de micrografías de inmersión en agua
   1. Descarga, instala y ejecuta el software ImageJ/Fiji.
   2. Ajusta la configuración de ImageJ haciendo clic en >Analizar > Establecer mediciones... y marque solo la casilla Valor medio de gris. Importe una imagen .tif haciendo clic en Archivo > Abrir... o arrastrando y soltando. Elija una región representativa de la imagen que esté enfocada y amplíela a 200%-300% presionando repetidamente Ctrl y + a la vez.
   3. Seleccione la herramienta Oval y, mientras presiona la tecla Shift, genere una selección circular en la imagen que sea significativamente más pequeña que un rabdomero fluorescente. Antes de soltar el botón del ratón, busque el tamaño exacto que se muestra debajo de la barra de herramientas en la ventana principal de ImageJ. Utilice el mismo tamaño de selección circular para todos los análisis.
      NOTA: El tamaño exacto de la selección circular en píxeles o micras depende de la configuración específica. Use un círculo de aproximadamente 1/3 o 1/4 del diámetro rabdomeral de las moscas de control de 1 día de edad, adaptadas a la oscuridad.
   4. Mueva la selección circular haciendo clic con el ratón sobre ella y arrastrándola o presionando las teclas de flecha en el teclado.
   5. Para medir las intensidades de fluorescencia dentro de la selección circular, mueva el círculo al primer rabdómero (r1) y haga clic en >Analizar > Medir o use el atajo Ctrl + M. Aparecerá una ventana de resultados que enumera el valor de gris medido.
   6. Continúe con mediciones de r2-r6 como mediciones repetidas y una medición de la señal de fondo (b). En el caso de moscas no pigmentadas, realice mediciones adicionales de las áreas del cuerpo celular correspondientes (c1-c6) (Figura 4).
   7. Repita los pasos 2.3.5 y 2.3.6 para dos omatidios más, lo que resulta en tres réplicas técnicas. Marque los omatidios analizados con la herramienta Lápiz y guarde esta imagen para la documentación.
   8. Seleccione y copie los valores de gris medidos de la ventana de resultados y péguelos en el software de hoja de cálculo para realizar cálculos adicionales. Ordene los valores de intensidad de fluorescencia según su origen en las categorías rabdómero (r), cuerpo celular (c) y fondo (b). Calcule la intensidad media de cada categoría (Ir, Ic, Ib).
   9. Calcula la cantidad relativa de eGFP presente en el rabdomere.
   10. Continúa con la siguiente imagen en el paso 2.3.3. Se recomienda utilizar imágenes de al menos cinco individuos de cada grupo experimental como réplicas biológicas para obtener una medición fiable.

Resultados

Figura 1: Espacio de trabajo de microscopía de inmersión en agua. Los materiales necesarios son: (A) tubo de centrífuga de 15 mL, (B) copos de hielo, (C) agua destilada enfriada, (D

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
15 mL centrifugage tube		188271
Carbon dioxide anaesthesia fly pad	Flystuff	59-172
Lámpara de luz fría (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
Microscopio de fluorescencia con lámpara UV, cámara, juego de filtros y software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)	Zeiss
Tubo fluorescente	Osram	4050300518039.00
Pipeta de laboratorio (20-200 μL)	Eppendorf
Object slide	Roth	656.1
Puntas de pipeta (200 μL)	Labsolute	7695844
Plasticine (Blu-Tack)	Bostik	30811745
Microscopio estereoscópico (SMZ445)	Nikon
Microscopio estereoscópico con lámpara UV, cámara, conjunto de filtros y software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica