Modelado de lesiones repetitivas en la cabeza por conmoción cerebral en un modelo de ratón

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Animal Care

1. Use ratones machos C57BL/6J de 3-4 meses de edad. Proporcionar ropa de cama, material de anidación, alimento y agua ad libitum. Mantenga los ratones a temperatura ambiente controlada a 20 - 22 °C con ciclos constantes de luz y oscuridad de 12 horas.

2. Preparación previa a la impactación

1. Fije una punta de metal recubierta de caucho de silicona hecha a medida a un dispositivo de impacto estereotáxico electromagnético. Asegúrese de que la parte inferior plana de la punta esté paralela a la superficie de la punta de la sonda (Figura 1A).
2. Anestesiar al ratón con isoflurano al 4% seguido de anestesia de mantenimiento con isoflurano al 2.5%. Compruebe la anestesia a través del caudalímetro. Controlar el nivel de anestesia hasta que el animal alcance un nivel quirúrgico de anestesia mostrando pérdida del reflejo de retirada del pedal.
3. Coloque el ratón en posición prona sobre una almohadilla térmica. Use un cono de nariz en forma de embudo para mantener al ratón bajo anestesia. Afeita completamente la cabeza con una recortadora. Use ungüento oftálmico de vaselina en los ojos del ratón para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.

3. Ajuste de parámetros de impacto

NOTA: El sistema de impacto incluye una caja de control para establecer los parámetros de impacto, un actuador para realizar la impactación y un marco estereotáctico digital con 3 ejes de movimiento.

1. Preajuste la velocidad del dispositivo de impacto a 4 m/seg y el tiempo de permanencia a 240 mseg en la caja de control.

4. Posicionamiento del centro

1. de impactoColoque una almohadilla térmica suave debajo del cuerpo del animal para mantener la temperatura corporal cerca de 39 °C. Monte el ratón en un marco estereotáctico en posición prona con las barras de las orejas de extremo romo.
2. Baje la punta de impacto cerca de la cabeza del ratón moviendo el controlador Z. Ajuste la punta de impacto plana (9 mm de diámetro) moviendo los controladores X e Y a mitad de camino a las coordenadas objetivo por encima de la sutura sagital.
3. Asegúrese de que un borde de la punta de impacto esté verticalmente paralelo a una línea horizontal imaginaria dibujada entre las dos orejas (Figura 1C). El centro de impacto corresponde a la sutura sagital central a medio camino entre las suturas interfrontal y lambdoidea (interaural 9 mm a interaural 0 mm, lateral 4,5 mm).

5. Ajuste de Profundidad de Impacto

1. Para ajustar correctamente la profundidad de impacto, use una punta de sonda adicional para reemplazar la punta de impacto aislada recubierta de caucho de silicona.
2. Para asegurarse de que no hay desplazamiento del centro de impacto después de cambiar las puntas, ponga a cero los canales X e Y en el panel de control estereotáxico digital antes de cambiar las puntas.
3. Mueva la punta de la sonda al centro del área de impacto moviendo manualmente las unidades X e Y.
4. Sujeta el sensor de contacto a la cola del ratón.
5. Mueva el impactador (unidad Z) hacia abajo hasta que la punta de la sonda toque la superficie del sitio del impacto.
6. Establece el canal Z en el panel de control estereotáxico a cero.
7. Mueve la punta de impacto hacia atrás al área de impacto ajustando manualmente los controladores X e Y (NO los botones cero en el panel de control estereotáxico digital) hasta que los controladores X e Y sean cero (donde se colocó previamente la punta de impacto).
8. Retraiga el actuador moviendo el interruptor de retracción en la caja de control. Mueva manualmente el impactador hacia abajo (controlador Z) 4 mm.

6. Impact

1. Activa el impacto haciendo clic en el interruptor de impacto en la caja de control y logra una profundidad de deformación de 4 mm.

7. Post-impactaction

1. Mide el tiempo desde el impacto hasta la primera respiración del ratón usando un temporizador.
2. Retire al animal del instrumento y colóquelo en una almohadilla tibia para mantener su temperatura corporal. No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
3. Permita la recuperación antes de devolver al animal a una jaula limpia. No devuelva un animal a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
4. Observa y pesa a los ratones a diario. Si los ratones muestran signos de dolor, inyectarles por vía intraperitoneal Meloxicam en dosis de 1 a 2 mg/kg cada 12 a 24 horas.

8. Repetitive Impaction

1. Dar a los ratones lesiones adicionales en los días 4, 7 y 10 después de la lesión inicial (intervalo de 72 horas entre impactos).

Figura 1. Un modelo de ratón de lesión craneal repetitiva por conmoción cerebral. (A) Punta recubierta de caucho de silicona de 1 mm de espesor hecha a medida y 9 mm de diámetro con una punta de sonda. (B) Un ratón está montado en un marco estereotáctico en una posición prona con una almohadilla térmica suave debajo del cuerpo. (C) El posicionamiento del centro de impacto. El borde de la punta de impacto es verticalmente paralelo a una línea horizontal imaginaria dibujada entre las dos orejas. El centro de impacto corresponde a medio camino entre las suturas interfrontales y lambdoideas (interaural de 9 mm a interaural de 0 mm, lateral de 4,5 mm). (D) La apnea se define como breves períodos de terminación transitoria de la respiración. La media y la desviación estándar se muestran en el panel inferior.