Detección de modificaciones de histonas en células de levadura con sobreexpresión de proteínas neurodegenerativas

Resumen

Fuente: Bennett, S. A., et al., Caracterización de las alteraciones de la modificación postraduccional de histonas en modelos de proteinopatía neurodegenerativa de levaduras. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra el procedimiento de evaluación de las modificaciones de histonas en células de levadura que sobreexpresan proteínas neurodegenerativas. Los pasos incluyen lisis celular, centrifugación, electroforesis, transferencia de membrana y detección de histonas modificadas basada en anticuerpos.

Protocolo

1. Lisis celular y western blot para detectar modificaciones

1. postraduccionales de histonasCell lysis
   1. Descongele los gránulos de células de levadura en hielo y resuspenda los gránulos de células en 100 μL de dH₂O.
   2. A la resuspensión celular, agregue 300 μL de NaOH 0.2 M y 20 μL de 2-mercaptoetanol. Vuelva a suspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   3. Incubar las células en hielo durante 10 min y luego centrifugarlas a 3.200 x g en una centrífuga de mesa durante 30 s en RT. Deseche el sobrenadante.
   4. Vuelva a suspender el pellet de celda en 100 μL de colorante de carga 1x y hierva durante 10 min en un bloque calefactor.
      NOTA: La receta para el tinte de carga 6x se puede encontrar en la Tabla de Materiales.
2. Electroforesis en gel de dodecil sulfato-poliacrilamida y transferencia de membrana
   1. Prepare la cámara de gel colocando dos geles en un soporte de gel, llenando la cámara interior hasta la parte superior con tampón corriente y llenando la cámara exterior hasta la marca de línea de dos geles.
   2. Cargue 15 μL de muestra por pocillo en un gel de poliacrilamida al 12% de 10 pocillos. Para el carril de escalera de proteínas, cargue 5 μL.
   3. Deje correr el gel durante aproximadamente 45 minutos a 150 V, o hasta que el frente de carga del tinte llegue al fondo del gel.
   4. Mientras el gel está funcionando, prepárese para la transferencia de membrana remojando almohadillas de fibra (dos por gel) en tampón de transferencia (Tabla de Materiales) y empapando la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) en metanol. Enjuague la membrana en el tampón de transferencia antes de la transferencia.
      NOTA: La membrana de PVDF debe cortarse al tamaño del gel y usar una membrana de PVDF por cada gel que se transfiera.
   5. Ensamble, en una celda de aparato de transferencia semi-seca, un 'sándwich' de transferencia: desde el electrodo inferior, coloque (1) una almohadilla de fibra previamente empapada, (2) membrana de PVDF previamente empapada y enjuagada, (3) gel, y (4) una segunda almohadilla de fibra pre-empapada.
      NOTA: Para evitar burbujas de aire en el 'sándwich' de transferencia, ' enrolle suavemente el 'sándwich' con una pipeta serológica para forzar la salida de las burbujas. Una vez que el gel se haya colocado encima de la membrana PDVF, no lo mueva.
   6. Para llevar a cabo la transferencia de proteínas, ajuste el paquete de energía a 150 mA durante 1 h (para un 'sándwich').
3. Detección de modificaciones postraduccionales de histonas (PTMs) con anticuerpos específicos de modificación
   1. Retire la membrana del aparato de transferencia. Enjuague brevemente con dH₂O.
      1. Opcionalmente, verifique la transferencia de proteínas con tinción de Ponceau-S vertiendo suficiente tinción de Ponceau-S para cubrir la membrana en una pequeña caja de plástico e incubando en RT con agitación suave durante 30-60 s. Retire la mancha de Ponceau-S y enjuague con dH₂O hasta que la mancha de fondo desaparezca y las bandas de proteínas sean visibles a simple vista. Continúe enjuagando con dH₂O hasta que se elimine toda la mancha de la membrana.
   2. Bloquea la membrana incubando el blot durante 1 h en RT con un balanceo suave en tampón de bloqueo de solución salina tamponada (TBS) tris (Tabla de Materiales) en una pequeña caja de tinción. Use suficiente tampón de bloqueo para cubrir la mancha.
      NOTA: Tenga cuidado de colocar la membrana en posición vertical en la caja de tinción para que el lado de la membrana en el que se encuentran las proteínas no quede hacia abajo.
   3. Incubar la mancha en la caja de tinción durante la noche con un anticuerpo específico de modificación de histonas reactivo hacia la levadura a 4 °C. Diluir el anticuerpo en tampón de bloqueo TBS según las especificaciones del fabricante. También incluyen un control adecuado de la carga nuclear, como el anti-H3 total generado en una especie huésped diferente del anticuerpo específico de la modificación. Por ejemplo, si se busca H3S10ph con un anticuerpo anti-H3S10ph criado en conejos, utilice un anticuerpo anti-H3 total criado en ratones como control de carga. Repita esto para cada mancha según sea necesario.
      NOTA: Las diluciones de anticuerpos se pueden reutilizar un total de tres veces en un mes. Guárdelos a 4 °C.
   4. Lavar la membrana 4 veces en TBS casero + 0.1% polisorbato 20 (TBST) durante 5 min con balanceo en RT.
   5. Incubar blot con anticuerpos secundarios fluorescentes en diluciones especificadas por el fabricante (donkey anti-rabbit 680 y donkey anti-mouse) durante 1 h en RT.
      NOTA: Los anticuerpos secundarios fluorescentes deben protegerse de la luz tanto durante el almacenamiento como durante el uso. Realice la incubación en cajas de plástico oscuras o cúbralas con papel de aluminio.
   6. Lava la membrana 4x con TBST durante 5 min y lava con TBS durante 5 min mientras te meces en RT.
   7. Visualice la mancha en un sistema de imágenes de Western blot fluorescente durante 2 min. Visualice los anticuerpos secundarios anti-conejo 680 y anti-ratón 800 en los canales de 800 nm y 700 nm, respectivamente.
      NOTA: Las réplicas se realizan de forma independiente a partir de la sección 1. Para una interpretación adecuada de los datos en estos experimentos, es necesario verificar que la respuesta de la señal del anticuerpo esté dentro del rango en el que la respuesta de la señal es lineal.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10x Running Buffer			Mezcla: 141,65 g de glicina (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g de Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g de dodecil sulfato de sodio (Sigma-Aldrich L3771) y 1 L de agua desionizada, pH 8,8.
12% Geles de Poliacrilamida	BIO-RAD	456-1041
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Antiacetil-histona H3 (Lys14) Primario Antibody	MilliporeSigma	07-353 (Lote No. 2762291)	Dilución: 1/1000
Antiacetil-Histona H4 (Lys16) Anticuerpo Primario	Abcam	ab109463 (Lote No. GR187780)	Dilución: 1/2000
Antiacetil-Histona H4 (Lys12) Anticuerpo Primario	Abcam	ab46983 (Lote No. GR71882)	Dilución: 1/5000
Anti-dimetil-histona H3 (Lys36) Anticuerpo primario	Abcam	ab9049 (Lote No. GR266894, GR3236147)<
Anticuerpo Primario Anti-Histona H3	Abcam	ab24834 (Lote No. GR236539, GR174196, GR3194335)	Control de carga nuclear; Dilución: 1/2000
Anti-fosfo-histona H2B (Thr129) Anticuerpo primario	Abcam	ab188292 (Lote No. GR211874)	Dilución: 1/1000
Anti-fosfo-histona H3 (Ser10) Anticuerpo primario	Abcam	ab5176 (Lote No. GR264582, GR192662, GR3217296)	Dilución: 1/1000
BioPhotometer D30	Eppendorf	6133000010
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (Nº de lote C60301-05, C61116-02, C80108-05)	Dilution: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	Dilución: 1/2500
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Papel de mancha extra grueso (papel de filtro)	BIO-RAD	1703968
Membranas de transferencia Immobilon-FL	MilliporeSigma	IPFL00010
Loading Dye			Mix: 1,2 g de dodecil sulfato de sodio, 6 mg de azul de bromofenol (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 mL glicerol, 1,2 mL 0,5M Trizma base pH 6,8, 0,93 g DL-Ditiothreitol ( Sigma-Aldrich D0632), y 2,1 mL de agua desionizada.
Methanol	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electroforesis Cell	BIO-RAD	1658004
pipeta multicanal	Eppendorf	2231300045
Nucleasa Free Water	Qiagen	129114
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biosciences	2800-03
pAG303GAL-a-synuclein-GFP	Regalo de A. Gitler
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43
Sigma-Aldrich	P4338	Prepare una solución al 50% c/v.
Ponceau S Stain	Sigma-Aldrich	P3504	Mix: 0.5 g 0.1% p/w de tinte Ponceau S, 5 mL 1% v/v de ácido acético (Sigma-Aldrich 320099) y 500 mL de agua desionizada.
PowerPac Basic Power Supply	BIO-RAD	164-5050
Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer			Almacenar a -20 oC. 6X, mezcla: 1,2 g de dodecil sulfato de sodio, 6 mg de azul de bromofenol, 0,93 g de DL-ditiotreitol, 2,1 mL de agua desionizada, 4,7 mL de glicerol y 1,2 mL de base Trizma 0,5 M, pH 6,8.
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	221465	Prepare la solución de 0.2 M.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)			Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) y 900 mL de agua desionizada.
TBS Blocking Buffer	LI-COR	927-5000
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell	BIO-RAD	170-3940
Transfer Buffer			Mix: 22,5 g de glicina, 4,84 g de base Tizma, 400 mL de metanol, 1 g de dodecil sulfato de sodio y 1,6 L de agua desionizada.
Tris-Buffered Saline (TBS)			10X, 7.6 pH, Solución: Mezcla 24 g de base de Trizma y 88 g de cloruro de sodio (Sigma-Aldrich S7653). Llene hasta 1 L con agua desionizada.
WT 303 S. cerevisiae yeast	Regalo de J. Shorter

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