Generación de un modelo esferoide tridimensional de invasión de células tumorales

Abstract

Fuente: Guyon, J., et al. Un modelo esferoide 3D para el glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)

El video muestra la generación de un modelo esferoide tridimensional de la invasión de células tumorales. Los esferoides se forman a partir de células tumorales cerebrales humanas y se incrustan en una matriz de colágeno. Las células tumorales en la periferia esferoide adoptan un fenotipo invasivo, secretando proteasas para degradar el colágeno y avanzando para invadir la matriz circundante.

Protocol

1. Generación de esferoides tumorales de tamaño uniforme

NOTA: Las células madre se cultivan en medio neurobasal complementado con suplemento de B27, heparina, factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2), penicilina y estreptomicina. Estas células forman espontáneamente esferoides en cultivo.

1. Lavar las células tumorales con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) e incubar las células con 0.5-1 mL de enzima de disociación durante 5 minutos a 37 °C.
2. Lavar con 4-4.5 mL PBS y añadir 10 mL del medio de crecimiento completo (medio neurobasal completo, cNBM).
3. Cuente las celdas utilizando una técnica de conteo automático con azul tripano y una diapositiva de cámara de conteo de celdas.
4. Para generar 100 esferoides con 10⁴ celdas por esferoide (según el tamaño preferido), mezcle 10⁶ celdas en 8 mL de NBM con 2 mL de metilcelulosa al 2%.
5. Transfiera la suspensión a un contenedor de sistema estéril y dispense 100 μL/pocillo con una pipeta multicanal en una placa inferior redonda de 96 pocillos.
6. Incuba la placa a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad. Se formarán esferoides de igual tamaño y se pueden usar después de 3-4 días.

2. Experimentos tridimensionales

1. Invasion
   1. Preparation
      1. Prepare la matriz de colágeno en un tubo sobre hielo con colágeno tipo I a una concentración final de 1 mg/mL, 1x PBS,_colágeno 0,023xV, hidróxido de sodio 1 M y H₂O estéril. Incubar la solución en hielo durante 30 min.
      2. Recoge los esferoides de la placa de pocillo de fondo redondo en tubos de 500 μL y lava 2x con 200 μL 1x PBS.
      3. Pipetea cuidadosamente los esferoides en 100 μL de la matriz de colágeno e insértalos en el centro de un pocillo en placas normales de 96 pocillos.
      4. Incuba el gel de colágeno durante 30 min a 37 °C y luego añade cNBM encima del gel. En este paso, se pueden agregar inhibidores o activadores (por ejemplo, cloruro de hidrógeno como se muestra en la Figura 1B, 1C).
   2. Adquisición y análisis de imágenes
      1. Tome fotografías secuencialmente con un microscopio de video en modo de campo claro 24 h después de la inclusión de colágeno.
      2. Utilice Fiji para analizar imágenes ya sea manualmente o de manera semiautomatizada. Para hacerlo manualmente, dibuje alrededor del núcleo y el área total del esferoide con la herramienta de selección a mano alzada y mida el área invasiva de cada esferoide restando el área total con el área del núcleo. Para analizar las imágenes de forma semiautomatizada, utilice una macro para determinar el área invasiva.

Results

Figura 1: Esferoide de glioblastoma P3 en ensayos de proliferación, invasión o migración. (A) Ensayo de proliferación. Panel izquierdo: Imágenes representativas con DMSO como control o con 20 μM de rotenona (inhibidor del complejo I de la cadena respiratoria) en el tiempo 0 o 72 h. Panel derecho: Cuantificación del área de esferoide representada como línea...

Materials