Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Extracción de α-sinucleína (αS) de regiones cerebrales disecadas
- Diseccionar un cerebro entero en una placa de Petri de plástico de 35 mm sobre hielo con una lupa de baja potencia (aumento de 8X) utilizando dos forcipes cuyos extremos se mantienen juntos, excepto cuando se disecciona el hipocampo. No exceda los 10 minutos para preservar la integridad del cerebro. Coloque el cerebro con el lado derecho hacia arriba y recupere las siguientes regiones del cerebro en este orden:
- Separe uno de los dos bulbos olfativos usando pinzas colocadas justo detrás de él. Sepáralo del cerebro moviéndolo hacia abajo. Repita esta operación para la segunda bombilla.
- Coloca suavemente las pinzas entre las dos cortezas y muévelas hacia adelante para facilitar la disociación de las dos cortezas. Manteniendo el cerebro en su lugar con una pinza, use otra para separar la corteza del hipocampo.
- Coloca las pinzas 2 mm por debajo de la corteza. Mantenga una presión suave sobre las pinzas hasta que la parte superior del hipocampo sea visible. Pela la primera parte de la corteza y repite con la segunda parte. Use las pinzas para separar las dos cortezas, comenzando en el hipocampo y moviéndose hacia la parte frontal del cerebro.
- Coloca las pinzas abiertas alrededor de uno de los hipocampos. Cierre las pinzas en la parte inferior del hipocampo y luego retírelas suavemente, recuperándose tanto como sea posible. Repita el procedimiento para el segundo hipocampo.
- Coloque las pinzas abiertas debajo de una de las estriadas y sepárela suavemente del cerebro. Use las pinzas para extraer cualquier corteza restante del cuerpo estriado. Repita este procedimiento para el segundo cuerpo estriado.
- Utilice las pinzas para presionar suavemente el contorno del cerebelo 2 mm para facilitar su separación del cerebro. Coloque las pinzas justo detrás del cerebelo y retírelas moviendo las pinzas hacia adelante.
- Use la parte ancha de las pinzas para elevar el mesencéfalo con el fin de ver claramente dónde se une con el tronco encefálico. Haga una incisión vertical en la unión y luego extraiga el tronco encefálico.
- Coloca las pinzas detrás del mesencéfalo, que está compuesto por cuatro estructuras redondeadas. Incidir verticalmente hasta que el mesencéfalo se haya separado completamente del cerebro restante.
- Prepare homogeneizados de porcentaje variable (peso/volumen) en tampón de alto contenido de sal (HS), dependiendo del número de tejidos disponibles: 5% homogeneizado para un peso entre 10 y 30 mg, 10% para un peso entre 30 y 80 mg, y 20% para un peso superior a 80 mg.
- Añade un volumen adecuado de tampón HS a las regiones cerebrales diseccionadas para obtener el % esperado de homogeneización.
- Vortex y comprueba que los tejidos están completamente inmersos en el tampón HS.
- Homogeneice muestras preparadas a partir de las regiones cerebrales disecadas o de la médula espinal cervical con un triturador de tejidos compuesto por un tubo de vidrio de borosilicato y dos morteros, A y B.
- Vierte cada región del cerebro para triturarla directamente en el tubo. Inserte el mortero A en el tubo y retírelo. Repite este movimiento unas diez veces para disociar el tejido. A continuación, utilice el mortero B para continuar triturando el tejido con otros 20 movimientos. Transfiera los homogeneizados a un tubo de 1,5 ml con una pipeta de transferencia de 1 ml.
- Centrifugar las muestras a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C para eliminar cualquier fragmento de cerebro no molido. Recuperar los sobrenadantes, dividirlos en alícuotas de 200 μl y mantenerlos a -80 °C para su posterior análisis.
1. Detección de αS por ELISA
- Diluya los anticuerpos del recubrimiento a 0.01 ng/ml. Utilice el anticuerpo policlonal o monoclonal clon 42 de conejo anti-αS en un tampón de 50 mM Na2CO3/NaHCO3 (pH 9,6).
- Cubra las microplacas de 96 pocillos con 100 μl por pocillo de esta solución de recubrimiento y déjelas a 4 °C O/N. Utilice el anticuerpo policlonal anti-αS de conejo en la solución de recubrimiento para ELISA utilizando los anticuerpos de detección syn514, clon 42, LB509, AS11, 4D6 o 8A5. Utilice el clon de anticuerpo monoclonal anti-αS 42 como solución de recubrimiento en combinación con el anticuerpo de detección anti-pSer129 αS.
NOTA: Si es necesario, las placas pueden mantenerse a 4 °C durante una semana antes de realizar el ELISA. - Use una arandela de placas para lavar las placas cinco veces con 300 μl de solución salina tamponada con fosfato con 0.05% Tween 20 (PBST) por pocillo. A partir de este paso, la incubación está en RT.
- Añade 200 μl de tampón de bloqueo T20 PBS (solución salina tamponada con fosfato) por pocillo. Agitar durante 1 hora a 150 rpm. Lave los platos cinco veces con PBST.
- Diluye los homogeneizados cerebrales (dilución 1:100 del 20% de homogeneizados, 1:50 del 10% de homogeneizados y 1:25 del 5% de homogeneizados en PBST BSA 1%), y añade 100 μl a cada pocillo. Luego incube durante 2 horas mientras agita a 150 rpm. Lave los platos cinco veces con PBST.
- Añade los diferentes anticuerpos de detección αS en PBST con albúmina sérica bovina (BSA) 1% en las diluciones mencionadas en la Lista de Materiales. Incubar durante 1 hora a 150 rpm. Lave los platos cinco veces con PBST.
- Agregue conjugados IgG HRP anti-ratón o anti-conejo diluidos 1:8,000 en PBST suplementado con BSA 1% durante 1 hora mientras agita a 150 rpm. Lave los platos cinco veces con PBST.
- Agregue 100 μl de solución de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo e incube durante 15 minutos en la oscuridad mientras agita a 150 rpm.
- Detenga la reacción añadiendo 100 μl de 1 N HCl por pocillo y luego mida la absorbancia a 450 nm con el lector de microplacas.
- Para el análisis de datos, reste el valor de OD obtenido en un pocillo con todos los reactivos excepto cualquier muestra de cerebro de ratón (pocillo en blanco) de los valores de OD medidos para cada una de las muestras analizadas.