Detección de la proteína α-sinucleína asociada a enfermedades neurodegenerativas mediante ELISA

Resumen

Fuente: Bétemps, D., et al., Detección de α-sinucleína asociada a enfermedades mediante ELISA mejorado en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan la α-sinucleína mutada A53T humana. J. Vis. Exp. (2015).

Este video muestra el procedimiento para detectar la proteína α-sinucleína asociada a enfermedades neurodegenerativas en tejido cerebral de ratones transgénicos utilizando ELISA. Los pasos incluyen la homogeneización de tejidos, la centrifugación y la detección ELISA de la proteína α-sinucleína para cuantificar sus formas asociadas a la enfermedad.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Extracción de α-sinucleína (αS) de regiones cerebrales disecadas

1. Diseccionar un cerebro entero en una placa de Petri de plástico de 35 mm sobre hielo con una lupa de baja potencia (aumento de 8X) utilizando dos forcipes cuyos extremos se mantienen juntos, excepto cuando se disecciona el hipocampo. No exceda los 10 minutos par....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
LB509		Abcam	ab27766	Detección de anticuerpos 1/2000
AS11		Producido en Anses		Detection antibody 1/1000
4D6		Abcam	ab1903	Detection antibody 1/2000
PSer129		Abcam	ab59264	Detection antibody 1/3000
PSer129 EP1536Y		Abcam	ab51253	Anticuerpo de detección 1/1000
Syn514		Abcam	ab24717	Detection antibody 1/500
Clone 42		BD Biosciences	610787	Anticuerpo de recubrimiento y detección (1/2000)
8A5		Proporcionado por el Dr. Anderson		Detection antibody 1/2000
Polyclonal anti-alpha syn antibody		Millipore	AB5038P	Anticuerpo de recubrimiento
Conjugado IgG HRP anti-ratón		Southern Biotech	1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate		Southern Biotech	4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugado		Dianova	115-035-164
HS buffer	Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B	Ajustar a pH 7.5 y mantener a 4°C
NaCl 750 mM<	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM<	43815
PBS	Fosfato de hidrógeno disódico1 mM	Euromedex	1309	Ajustar a pH 7.5
Monopotasshate 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl 137 mM<	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20		Euromedex	2001-C
BSA		Sigma	A7906
Microplate MaxiSorpTM		Thermo Scientific	442404
Carbonato de tampón 50 mM pH 9.6	Carbonato de sodio decahidratado	Sigma	71360	2.86 g/L
Sodium bicarbonate	Merk	6329	3.36 g/L, pH9.6
Superbloque T20 PBS búfer de bloqueo		Pierce	E6423H	10 X concentrated
TMB		Sigma	T0440	Used for ELISA
TMB		Analytik Jena AG	847-0104200302	Utilizado para el mapeo
HCl 1N		Chimie plus	40030
Ribolyser		Thermo	Preparación rápida FP120	Mantén el hielo en este paso
Grinding tubes		Biorad	355-1197
Lavadora de placas		Tecan	Columbus Pro
Plate reader		Biorad	Model 680
Lupa de baja potencia		VWR	630-1062	X8 magnification
Gripps Dumont#7		WPI	14097	Para pasos
Pipeta de transferencia 1ml Samso		Samso	43231
1.5 ml tubes		Dutscher	33290

td style='width:200pt;'>Euromedextd style='width:200pt;'>Sigmatd style='width:200pt;'>Euromedex de epítopos de disección