Modelado de metástasis de tumores cerebrales mediante la inyección de células cancerosas en la arteria carótida interna

Resumen

Fuente: Lim, M., et al. Modelado de metástasis cerebrales mediante inyección de células cancerosas en la arteria carótida interna. J. Vis. Exp. (2022)

En este video, un ratón anestesiado se somete a un procedimiento quirúrgico en el que se inyectan células cancerosas en la arteria carótida común (CCA) para facilitar la entrega dirigida al cerebro. El procedimiento implica la sutura y manipulación precisas de las arterias carótidas para dirigir las células inyectadas hacia la arteria carótida interna (ACI), promoviendo la formación de tumores en el cerebro con el tiempo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de células cancerosas para inyección

NOTA: En este estudio, se utilizó la línea celular de cáncer de mama humano, BT-474 (BT474). BT474 se cultivó en un medio de crecimiento completo compuesto por el medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de insulina. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 °C con 5% de dióxido de carbono en la atmósfera. Autentificar la línea celular mediante pruebas de repetición en tándem por satélite, confirmar la expresión de la proteína reportera (por ejemplo, luciferasa), si la hay, y comprobar si hay infección por micoplasma.

1. Siembre células cancerosas BT474 con una densidad de siembra de 2,0 × 10^6 células en un matraz T75 utilizando 10 mL de medio de crecimiento completo y cultivo (a 37 °C con 5% de dióxido de carbono) hasta una confluencia del 70%-80% antes de la inyección.
2. El día de la inyección, deseche los medios de crecimiento y lave la monocapa celular dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Añadir 5 mL de reactivo de disociación de cultivo celular precalentado e incubar a 37 °C durante 5 min o hasta que las células se hayan desprendido. Después de 5 minutos, golpee suavemente el matraz para ayudar al desprendimiento de las células.
4. Agregue 5 mL de medio de crecimiento completo que contenga un 10% de suero fetal bovino para apagar la actividad del reactivo de disociación.
5. Vuelva a suspender suavemente las células pipeteando para reducir los grupos de células.
6. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mL y centrifugue a 180 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
7. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 10 mL de Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS) sin calcio ni magnesio para minimizar la aglomeración celular.
8. Centrifugar la suspensión celular a temperatura ambiente a 180 x g durante 3 min.
9. Decantar el sobrenadante para eliminar el suero/reactivo de disociación residual y resuspender el pellet de la célula en 3 mL de HBSS.
10. Coloque un colador de células de 100 μm en un tubo cónico nuevo de 50 ml y pase la suspensión de células para eliminar los grumos de células.
    NOTA: Una suspensión unicelular es esencial para minimizar la oclusión de los vasos sanguíneos y el riesgo de accidente cerebrovascular en la inyección.
11. Calcule el número de células viables utilizando la exclusión de azul de tripano y un hemocitómetro utilizando métodos estándar.
12. Diluya la suspensión celular con HBSS hasta una concentración celular de 2,5 x 10⁶ células/mL.
13. Mantenga el tubo horizontal sobre hielo y balancee suavemente el tubo periódicamente para minimizar la formación de grumos. La suspensión de la celda se puede almacenar en hielo durante un máximo de 6 h.
    NOTA: El balanceo se hizo manualmente, pero también se puede hacer usando un agitador a bajas revoluciones.

2. Preparación del ratón para el procedimiento

NOTA: En este estudio, se utilizaron ratones hembra NOD scid de 4-5 semanas de edad. Introduzca alimentos de recuperación para la dieta blanda (por ejemplo, gel dietético, hidrogel, comida de ratón triturada) a los ratones 3 días antes del procedimiento para fomentar la alimentación después del procedimiento.

1. Herramientas quirúrgicas en autoclave. Rocíe y limpie el área quirúrgica y el equipo con desinfectante de superficies, seguido de etanol al 70%.
2. Coloque una colchoneta térmica para animales debajo de la tabla quirúrgica para evitar la hipotermia. Enciéndalo 30 minutos antes de la cirugía. Rocíe y limpie la placa quirúrgica con desinfectante de superficies, seguido de etanol al 70%.
3. Prepare una jaula limpia para animales y una almohadilla térmica tibia para la recuperación.
4. Póngase equipo de protección personal limpio (bata, mascarilla, redecilla para el cabello y guantes). Mantenga la esterilidad durante todo el procedimiento utilizando guantes de examen limpios y una técnica de "solo puntas de instrumentos".
5. Anestesiar al ratón con una cámara anestésica utilizando isoflurano al 5% con un flujo de oxígeno de 2 L/min hasta que el ratón pierda el reflejo pedal.
6. Sacar al animal de la cámara y colocarlo en un cono nasal que suministre isoflurano al 2% a un flujo de oxígeno de 2 L/min para el procedimiento quirúrgico restante.
7. Ratón perforador de orejas para la identificación y uso de maquinillas eléctricas para afeitar el pelaje de la región del cuello. Limpie el exceso de vello de la piel expuesta con cinta adhesiva.
8. Pesar el ratón para calcular las dosis de anestésicos y analgésicos necesarias. Administrar buprenorfina y meloxicam a 50 μg/kg y 1 mg/kg, respectivamente, por inyección subcutánea.
9. Transfiera el mouse a una tabla quirúrgica tibia y asegure el cono de la nariz con cinta adhesiva.
10. Aplique lubricante ocular en los ojos para evitar que se sequen.
11. Asegure el ratón suavemente enganchando primero los dientes incisivos superiores con hilo pegado a la tabla quirúrgica, seguido de la cinta adhesiva en las patas delanteras y traseras. Este paso extiende el cuerpo y mantiene el cuello recto durante el procedimiento.
12. Realice la preparación preoperatoria de la piel como se describe a continuación.
    1. Limpie el cuello con un antiséptico tópico (povidona yodada) para reducir la carga de microflora de la piel y eliminar el vello suelto. Limpie desde el centro de la piel, trabajando hacia afuera para evitar la recontaminación del sitio de la incisión. Repita el proceso usando etanol al 70%. Realice tres rondas alternas de yodo y etanol para la desinfección.
    2. Coloque un paño quirúrgico sobre el animal. Esto se corta y se hace a partir de un trozo de toalla de papel estéril o una bolsa de autoclave.
13. Coloque toallas de papel estériles o bolsas de autoclave para herramientas quirúrgicas.
14. Compruebe si hay reflejo via 'Prueba de pellizco' para asegurar suficiente anestesia antes de continuar con el procedimiento.

3. Inyección de carótida interna

NOTA: En este experimento, se utilizó una cánula de infusión de 31 G y una configuración de controlador de jeringa activada por el pie para facilitar el procedimiento de inyección. Esta configuración es opcional, y el usuario puede usar una jeringa de insulina de 31 G y omitir los pasos 3.11 y 3.12. Para preparar la cánula de infusión, tire y separe la parte de la aguja de la parte del ajuste de la jeringa de una aguja de 31 G utilizando dos pares de pinzas de sutura. A continuación, fije la parte de la aguja a un extremo de un tubo de infusión fina de aproximadamente 10 cm de largo.

1. Coloque el microscopio de disección sobre el ratón.
2. Con unas tijeras, haga una incisión vertical de 15 mm a lo largo de la línea media en la región del cuello, comenzando desde 5 mm por debajo de la mandíbula hasta la entrada torácica.
3. Con dos pares de pinzas en ángulo, separe la piel y las glándulas salivales subyacentes y aplique retractores para mantener la tráquea expuesta. El siguiente paso expondrá la vaina carotídea que se encuentra paralela a la tráquea.
4. Con dos pares de pinzas de ángulo fino, diseccione sin rodeos el músculo y el tejido graso adyacente a la tráquea para exponer la vaina carotídea derecha. La vaina carotídea es la capa fibrosa que cubre la arteria carótida común, la vena y el nervio vago, y este haz se puede visualizar mediante la arteria carótida común de color rojo brillante. En este estudio, la inyección se realizó en la arteria carótida derecha.
5. Despejar un segmento de la arteria carótida común caudal a la bifurcación carótida de la fascia circundante y separarla del nervio vago y las venas.
6. Aísle y limpie la bifurcación carotídea (la unión que une las arterias carótidas externa e interna) de los nervios y la fascia circundantes. Coloque pinzas finas debajo de la arteria carótida externa y pase una sutura de seda (grosor 5-0) debajo de la arteria. Anudar y apretar la sutura y cortar el exceso de línea.
   NOTA: Esta ligadura (L1) evitará que la inyección transite a través de la arteria carótida externa.
7. Coloque pinzas finas debajo de la arteria carótida común y pase una sutura de seda (5-0 de grosor) debajo de la arteria. Haga un nudo y apriete la sutura en una posición proximal al sitio de inyección propuesto. Corta el exceso de sutura, dejando unos 10 mm de línea.
   NOTA: Esta segunda ligadura (L2) restringirá el flujo sanguíneo y el sangrado después de la inyección. También se utiliza para posicionar y sujetar la arteria carótida durante la inyección.
8. Corte y humedezca una tira de toallitas desechables (esterilizadas en autoclave) con poca pelusa de aproximadamente 10 mm x 5 mm. Doble la tira en 4 mm x 5 mm, de 2-3 mm de grosor, y colóquela debajo de la arteria carótida en el lugar de inyección propuesto. Esto sostendrá el vaso durante la inyección.
9. En la arteria carótida rostral común hasta el lugar propuesto para la inyección, se coloca una tercera ligadura (L3) con un nudo suelto. Esto se aprieta solo después de la inyección (en el paso 3.16).
10. Agite suavemente la suspensión celular y extraiga 200 μL de suspensión celular en una jeringa de insulina (con una aguja de 31 G).
11. Cargue la jeringa en el controlador de la jeringa, que está conectado a un pedal de activación.
12. Coloque una cánula fina con una aguja de 31 g en la jeringa y cebe la vía.
13. Compruebe si la arteria carótida está bien posicionada y presurizada.
14. Con dos pinzas de ángulo fino, una que tensa suavemente el extremo de la primera ligadura y la otra que sostiene la aguja de 31 G, inserte lentamente la aguja con bisel en la luz del vaso sanguíneo con cuidado de no perforarla.
15. Inyecte lentamente 100 μL de suspensión celular (desde el paso 1.13) en la arteria carótida común a 10 μL/s. Esto entregará 2,5 × 10^5 células en el vaso sanguíneo. El éxito de la inyección se visualiza a través de la limpieza de la sangre del vaso sanguíneo carotídeo.
16. Levante y apriete suavemente la ligadura suelta (L3) (a partir del paso 3.9) inmediatamente después de retirar la aguja para evitar el reflujo y el sangrado. Recorta el exceso de sutura.
    NOTA: Es normal observar una pequeña cantidad de sangre brotando después de retirar la aguja. Sin embargo, no debe haber ningún sangrado activo después de apretar la tercera ligadura.
17. Retire el trozo de toallitas desechables humedecidos con poca pelusa.
18. Con una pipeta P200, enjuague la cavidad quirúrgica dos veces con 150-200 μL de agua estéril o solución salina.
19. Vuelva a verificar si hay sangrado y luego retire los retractores.
20. Vuelva a colocar el tejido blando, las glándulas salivales y la piel sobre la arteria carótida y la tráquea.
21. Cierre la capa de piel de la incisión con un soporte de aguja de sutura, pinzas y una sutura de monofilamento 6/0 absorbible o no absorbible en un patrón continuo.
22. Deseche la jeringa de la aguja de la cánula y prepare una nueva configuración para el próximo ratón. El uso de una jeringa nueva asegurará que el número de células inyectadas en cada ratón sea constante.
    NOTA: Se encuentran instantáneas representativas del procedimiento. Si el vaso es perforado o desgarrado por la aguja, indicado por la fuga de inyectado o sangrado, el procedimiento se considera infructuoso. Después de esto, se debe retirar la aguja y apretar inmediatamente la tercera ligadura para evitar un mayor sangrado. Si el sangrado es persistente después de tensar la sutura, el animal debe ser sacrificado con pentobarbital.

4. Recuperación post-inyección

1. Inyecte buprenorfina (50 μg/kg) y meloxicam (1 mg/kg) vía inyección subcutánea como alivio del dolor postquirúrgico.
2. Traslade al animal a una jaula cálida y limpia para recuperarse de la anestesia. Es normal que un animal tenga una actividad moderada (acurrucado e inactivo o moviéndose lentamente) después de despertarse.
3. Después de 30-45 minutos, transfiera los ratones a un centro de retención a largo plazo.
4. Proporcione a los ratones una dieta blanda (gel dietético, hidrogel, puré) durante al menos una semana después de la cirugía y controle el estado físico diariamente con especial atención a los signos de accidente cerebrovascular, infección y sangrado alrededor del sitio de la herida.
5. Dos días después de la cirugía, es típico que el animal tenga una actividad reducida, un pelaje ligeramente ondulado y haya perdido el 15% del peso corporal preoperatorio. Administre analgésico (meloxicam) diariamente durante 2-3 días después de la cirugía para controlar el dolor y ayudar a la recuperación.
6. A partir del día 3, los animales deben haber recuperado la actividad, haber aumentado la frecuencia de alimentación y acicalamiento, y haber recuperado peso. Sacrificar a los animales con déficits persistentes de condición física (dolor, acurrucados, inactivos, pérdida de peso) después de 4 días después de la cirugía inyectando pentobarbital sódico a 200 mg/kg via inyección intraperitoneal.
7. El injerto y la progresión del tumor se pueden controlar mediante anestesia y la modalidad de diagnóstico por imágenes de elección, como imágenes bioluminiscentes, resonancia magnética o PET/RMN. El requisito y la capacidad para llevar a cabo dichas imágenes dependerán inherentemente de los objetivos individuales del proyecto y de la instalación en la que se lleven a cabo, y dependiendo del tipo de etiqueta reportera, de las líneas celulares utilizadas, de la accesibilidad de las instalaciones radioquímicas y de imágenes nucleares pertinentes.
   NOTA: Algunos animales pueden no responder bien y experimentar un derrame cerebral a pesar de un procedimiento exitoso. Después del procedimiento, los animales que presenten algún síntoma de malestar neurológico (girar la cabeza y tirar hacia un lado, comportamiento de círculos, rodar, golpearse, pérdida de la función motora) deben ser sacrificados inmediatamente.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática del protocolo de inyección de la arteria carótida interna para la metástasis cerebral. La inyección de la arteria carótida interna con ligadura de la arteria carótida externa puede producir de manera confiable un modelo de metástasis cerebral de varios cánceres primarios. En este protocolo, se colocan tres l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insulina jeringa	BD	326103
Pinzas en ángulo	Proscitech	T67A-SS	Punta fina, angulada sin dentados, punta de 18mm, longitud 128 mm
Estera
Antibiótico y antimicótico	ThermoFisher Scientific	15240062
BT-474 (HTB-20) línea celular de cáncer de mama	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Microscopio
Ear perforadora
Cortapelas eléctricas	Pinzas de ángulo fino Proscitech DEF11063-07 Angulado 45°, Punta lisa, Ancho de la punta: 0,4 mm, Dimensión de la
		punta: 0,4 x 0,3 mm, longitud 9cm
Tubo fino para cánula, Diámetro exterior del tubo (pulgadas) 1/32, Diámetro interior del tubo (pulgadas) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Suero fetal bovino	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium	ThermoFisher Scientific	14170120
Isoflurano
Kimwipes Limpiaparabrisas desechables de baja pelusa	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Cono			de narizFabricado a partir de un tubo
Lubricante ocular PAA (Carbómero 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidona solución de yodo	Betadine	2505692
PPE (guante, mascarilla, bata, redecilla)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Sutura de seda 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Solución salina normal estéril	ThermoFisher Scientific	TM4469
Sticky tape
Surgical board			Una tabla de cortar envuelta con una bolsa esterilizable en autoclave.
Tijeras quirúrgicas	Proscitech	T104	Dimensiones de la punta (LxD): 38x7mm, longitud 115mm
Pinza de sutura/ Pinza Brophy curvada	Proscitech	T113C	Curvada, Redondeada punta estrecha de 2 mm, con dentados, longitud 165 mm
Portaagujas de sutura (Portaagujas Olsen Hegar)	Proscitech	TC1322-180	longitud 190 mm, pinza de trinquete
Controlador de jeringa con pedal/UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 matraz de cultivo de tejidos	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II desinfectante de superficies	Ceva

térmica animal de disección de microfuga