Análisis LC-MS/MS del perfil proteómico de gránulos de neuromelanina aislados de tejido cerebral humano

Resumen

Fuente: Wulf, M., et.al. Protocolo basado en microdisección láser para el análisis LC-MS/MS del perfil proteómico de gránulos de neuromelanina. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra el análisis de muestras de péptidos de gránulos de neuromelanina (NMG) aislados de tejido cerebral postmortem humano. Los péptidos se separan primero mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y luego se analizan mediante espectrometría de masas para determinar sus relaciones masa-carga (m/z). Los péptidos objetivo se fragmentan para identificar las modificaciones postraduccionales y los datos resultantes se comparan con una base de datos de referencia para determinar el perfil proteómico de los NMG.

Protocolo

1. Digestión tríptica

1. Descongele las muestras en hielo.
2. Seque completamente las muestras en un concentrador de vacío.
3. Llene la muestra con 50 μL de un tampón de digestión adecuado, por ejemplo, 50 mM de bicarbonato de amonio.
4. Después de la adición de 1,25 μL de 1,4-ditiotreitol de 200 mM, incubar las muestras durante 30 min a 60 °C y 300 rpm con un termomezclador y enfriarlas a temperatura ambiente (RT) posteriormente.
5. A continuación, incubar las muestras en RT durante 30 min en la oscuridad después de la adición de 1,36 μL 0,55 M de yodoacetamida.
6. Añadir una cantidad adecuada de tripsina a las muestras e incubar las muestras durante la noche (~16 h) a 37 °C.
NOTA: Para 1.000.000 μm², se encontró que 0,1 μg de tripsina eran suficientes.
7. Añadir 2,6 μL de ácido trifluoroacético (TFA) al 10% a las muestras para detener la digestión (concentración final de 0,5% de TFA).
8. Seque completamente las muestras con un concentrador de vacío. A continuación, llene las muestras hasta un volumen final definido con un 0,1% de TFA. Las muestras de NMG se llenaron hasta 20 μL, de los cuales 5 μL se utilizaron para un experimento de espectrometría de masas (MS).
9. Almacene las muestras a -80 °C hasta su uso posterior. Determine la concentración de péptidos mediante análisis de aminoácidos u otro método de cuantificación adecuado (por ejemplo, detección directa).
NOTA: Es posible que cantidades bajas de muestras no sean cuantificables utilizando las técnicas mencionadas. Para garantizar una carga de muestra idéntica, cada muestra debe contener la misma cantidad de tejido aislado y cada muestra debe tratarse por igual.

2. Cromatografía líquida de alto rendimiento y espectrometría de masas

NOTA: Los siguientes análisis de espectrometría de masas (MS) de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) están optimizados para el sistema LC específico con un dispositivo de columna de captura y un espectrómetro de masas utilizados aquí (ver Tabla de Materiales). Para otros sistemas LC y MS, se recomienda la adaptación de los parámetros.

1. Utilizando el software Xcalibur, ajuste la configuración de HPLC de la siguiente manera.
   1. Columna de trampa: Ajuste la temperatura a 60 °C, el caudal a 30 μL/min, el tampón de funcionamiento al 0,1% de ácido trifluoroacético.
   2. Columna analítica de fase reversa C18: Ajuste la temperatura a 60 °C, el caudal a 30 μL/min, el tampón de funcionamiento A al 0,1% de ácido trifluoroacético, el tampón de funcionamiento B al 84% de acetonitrilo y el gradiente al 5%-30% del tampón de funcionamiento B durante 98 min.
      NOTA: La adaptación del gradiente puede ser inevitable y se recomienda encarecidamente cuando se utilizan diferentes tejidos o células. El tiempo total del gradiente puede variar debido a la carga de la muestra al principio del gradiente y al lavado de la muestra al final del gradiente. El gradiente total en este protocolo consiste en una carga de muestra de 7 min y un lavado de columna adicional durante 15 min, lo que da como resultado un tiempo de gradiente total de 120 min.
2. Cree un método de adquisición dependiente de datos (DDA) utilizando la Configuración del Instrumento XCalibur, que se puede encontrar en el menú de la hoja de ruta del software HPLC.
3. En la pestaña Parámetros Globales, defina el modo de infusión Cromatografía Líquida, el Ancho de Pico LC Esperado (30 s) y el estado de carga Predeterminado (2).
4. Proceda a la pestaña Parámetros de escaneo y agregue los siguientes escaneos y filtros en el orden mencionado: MS OT, MIPS, Intensity, Charge State, Dynamic exclusion y ddMS2 OT HCD.
   Los ajustes óptimos de MS y DDA pueden variar para el espectrómetro de masas específico utilizado, así como para el tipo de muestra y, por lo tanto, deben adaptarse.
5. Prepare muestras disolviendo 200-400 ng de péptidos de muestra en un volumen definido de 0.1% TFA en entradas de viales de vidrio de espectrometría de masas inertes. Si la determinación de la concentración no es aplicable debido a la baja cantidad de muestra, verifique la carga idéntica de la muestra comparando la corriente iónica total (TIC).
   NOTA: Para hacer esto, abra el archivo resultante de la medición de espectrometría de masas en un software adecuado, por ejemplo, FreeStyle, y verifique el cromatograma. Las intensidades deben ser comparables para todas las muestras. En la Figura 1 se muestra un TIC representativo.
6. Analice los datos brutos obtenidos utilizando un software adecuado para la proteómica, por ejemplo, MaxQuant, Progenesis QI for Proteomics o Proteome Discoverer, y realice un análisis de datos estadísticos basado en la pregunta de investigación.

3. Análisis de datos brutos proteómicos utilizando MaxQuant

1. Cargue archivos sin procesar en el software MaxQuant en el encabezado de datos sin procesar haciendo clic en Cargar.
2. Asigna nombres de muestra haciendo clic en Establecer Experimento.
3. Define parámetros específicos del grupo. Primero, agregue modificaciones. Debido al procesamiento de la muestra, elija la desamidación (NQ), la oxidación (M) y la carbamidometilación (N-término) como modificaciones variables, y agregue la carbamidometilación (C) como modificación fija.
4. Elija Tripsina como enzima de digestión en la pestaña Digestión.
5. Añade la opción de cuantificación sin etiquetas LFQ en la pestaña Cuantificación sin etiquetas. Si se van a procesar más de 10 archivos, elija la opción LFQ rápido para acortar el tiempo de procesamiento. Agregue la opción iBAQ como medida para la cuantificación de proteínas.
6. Asegura que todos los demás parámetros específicos del grupo permanezcan en la configuración de fábrica.
7. Vaya a la pestaña Parámetros Globales y agregue el archivo FASTA derivado de uniprot.org en la pestaña Secuencias. Modifique la regla del identificador en consecuencia y agregue el ID de taxonomía, en este caso, 9606 para homo sapiens.
8. Para la cuantificación de proteínas, elija los péptidos Unique y Razor.
9. Asegura que todos los demás parámetros globales permanezcan en la configuración de fábrica.
10. Haga clic en Iniciar y recupere la salida proteingroups.txt después del análisis MaxQuant para un análisis más detallado en Perseus.

Resultados

Figura 1: Corriente iónica total (TIC) de una medición DDA de 120 min. El cromatograma muestra la abundancia relativa de los iones correspondientes a los péptidos ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,4-dithiothreitol	AppliChem	A1101
Acetonitrile	Merck	1.00029.2500
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	A6141
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	56302
Iodoacetamida	AppliChem	A1666,0100
Micro Tube 500	Carl Zeiss	415190-9221-000
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeam	Zeiss	494800-0014-000
Ácido trifluoroacético	Merck	91707
Trypsin sequencing grade	Serva	37283.01
Ultimate 3000 RSLC nano LC system	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Name of Software	Weblink/Company	Version
FreeStyle	Thermo Fisher Scientific	1.6
MaxQuant	https://www.maxquant.org/	1.6.17.0
PALMRobo	Zeiss	4.6 pro
Perseus	https://www.maxquant.org/perseus/	1.6.15.0
Skyline	https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view	20.2.0.343
XCalibur	Thermo Fisher Scientific	4.3