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1. Generación de esferoides tumorales de tamaño reproducible
- Recoge las neuroesferas (NS) mutantes del glioma difuso de la línea media (DMG) H3K27M y centrifuga a 170 x g durante 10 minutos (min) a temperatura ambiente (RT).
- Para romper el NS, incubar 500 μL de la solución de accutasa durante 3 min a 37 °C.
- Neutraliza la solución de accutasa con célula madre tumoral (TSM) medium7 y centrifugar el suspensión de celda a 355 x g durante 5 min en RT.
- Vuelva a suspender el pellet de celdas en 1 mL de medio TSM y luego continúe las celdas usando una cámara de conteo de celdas.
- Diluya la suspensión de la celda para obtener 2.5-5 x 103 células/mL y semilla 100 μL/pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos de fijación ultra baja (ULA) (ver Table of Materials). Utilice una densidad celular adecuada para obtener NS individuales de ~300 μm de diámetro, 4 días después de la siembra celular (250-500 células/pocillo para células de glioma altamente agresivas).
- Confirmar visualmente la formación de NS mediante el uso de un microscopio invertido 4 días después de la siembra de la célula.
2. Preparación del reactivo de marcaje de anticuerpos (ALR)/complejo de anticuerpos y configuración para el ensayo de migración
- Considere el número de pocillos para analizar y calcular el volumen necesario para cada reactivo. Incluya también los pocillos necesarios para los controles negativos. Compruebe visualmente el SN con un microscopio invertido antes de empezar.
- Utilice placas de fondo plano de 96 pocillos. Realizar el recubrimiento. Para este estudio, se utiliza la matriz de membrana basal (BMM) como recubrimiento fino.
- Una vez que el recubrimiento esté listo, retire el exceso de recubrimiento BMM con una punta p200, colocando la punta en el borde del pozo y evitando tocar el fondo. Si trabaja con varios pocillos, utilice una pipeta multicanal.
- Corte una punta p200, tome 50 μL del medio celular + NS de cada pocillo seleccionado y transfiéralo a un pocillo de fondo plano recubierto. Verifique visualmente la presencia y la posición del NS en cada pozo.
NOTA: Cada NS debe estar ubicado en el centro del pozo. Evite apoyarse en la punta en el borde del pozo durante la transferencia, pero deje caer el medio en el centro del pozo sin tocar el fondo. En el caso de las células altamente migratorias, considere un mayor número de réplicas que las tres réplicas estándar. Esto se debe a que cuando NS se encuentra demasiado cerca del borde del pocillo, las células migratorias pueden cubrir un área más pequeña del pocillo. - Añadir 100 μL de agua estéril al ALR para rehidratar el reactivo (concentración final = 0,5 mg/mL). Pipetea para mezclar la solución. NOTA: El reactivo es sensible a la luz; Por lo tanto, manténgase en la oscuridad. Alicuente el reactivo sobrante y almacene a -80 °C (evite congelar y descongelar).
- Mezcle el anticuerpo con ALR en el medio de crecimiento celular completo apropiado, en una placa de pocillos múltiples de fondo redondo o en un tubo ámbar y protéjalo de la luz. Prepare una cantidad suficiente para dispensar 50 μL/pocillo a una concentración de ensayo final 3x. Incubar en RT durante 15 min.
- Diluir el reactivo supresor de fondo (BSR) en medio TSM (o medio de crecimiento celular adecuado para la línea celular de elección) a 1,5 mM (3x) para obtener al final del ensayo una concentración final de 0,5 mM.
NOTA: reactivo es sensible a la luz. Consulte más arriba para conocer los buenos procedimientos de manejo. - Agregue suavemente 50 μL de BSR a cada pocillo.
- Agregue suavemente 50 μL de ALR/anticuerpo a cada pocillo. Espere 2 o 3 minutos para que los reactivos se mezclen y verifique visualmente con un microscopio invertido para asegurarse de que la mayoría de los NS replicados estén ubicados en el centro del pocillo.
- Evite la formación de burbujas y elimine las existentes con una aguja. Transfiera suavemente la placa en el instrumento de análisis de células vivas colocado dentro de la incubadora a 37 °C, 5% CO2, 95% de humedad.
3. Configuración del instrumento de análisis de células vivas para la adquisición de imágenes
- Escanea las placas utilizando el instrumento de análisis de células vivas (para conocer las especificaciones, consulta Table of Materials) con intervalos de escaneo a partir del punto de tiempo cero (t0) de los ensayos de invasión y migración configurados, respectivamente, después del paso 2.14. y 3.10. hasta 96 h.
NOTA: Asegúrese de poder desechar el instrumento de análisis de células vivas inmediatamente después del inicio del ensayo de invasión y migración. Dependiendo del tipo de tumor, las células pueden comenzar a invadir o migrar desde el SN ya dentro de 1 h desde la configuración del ensayo. - En el software del instrumento de análisis de células vivas, seleccione la opción Schedule to Acquire. Haga clic en la pestaña + pestaña y seleccione la opción Scan on Schedule.
- En la ventana del software Create or Restore Vessel, haga clic en la opción New<span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>.
- Seleccione la aplicación específica en el instrumento de análisis de células vivas para la adquisición de invasión y migración. Seleccione Spheroid scan type, 4x objective, Phase+Brightfield y Green canales de imagen para el ensayo de invasión. Seleccione Dilution Cloning tipo de escaneo, objetivo 4x y Phase and Green para el ensayo de migración.
- Seleccione el tipo de placa y defina los pozos que se van a escanear resaltándolos en el mapa de placas.
- Configure la frecuencia de escaneo (para los experimentos en este protocolo, la frecuencia de escaneo fue de 15 min para la invasión y 30 min para la migración).
- Haga clic en Add to Schedule y comience el escaneo.