Caracterización de esferoides tumorales neuroendocrinos de intestino delgado mediante inmunofluorescencia

Resumen

Fuente: Ear, P. H., et. al. Establecimiento y caracterización de esferoides tumorales neuroendocrinos del intestino delgado. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra la tinción por inmunofluorescencia de esferoides tumorales neuroendocrinos del intestino delgado. Los esferoides se fijan, permeabilizan y bloquean y luego se incuban con anticuerpos primarios y secundarios. Se añade un tinte a los núcleos de tinción antes de montarlos y visualizarlos bajo un microscopio fluorescente.

Protocolo

1. Colección de tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNET) y disociación

1. celularObtenga muestras de SBNET de pacientes resecadas después de la confirmación de tejido tumoral del Núcleo de Patología Quirúrgica.
2. Corta SBNETs en cubos de 5 mm y guárdalos en 25 mL del medio Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 de Dulbecco en un tubo cónico para transportarlos al laboratorio.
3. Transfiera los tumores a DMEM que contengan 1% de suero fetal bovino o FBS, 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) y 1% de glutamina (Medio de lavado), e incube en este medio de lavado durante 15 min.
4. Transfiera los tumores a un nuevo plato y córtelos en pedazos de menos de 1 mm de diámetro utilizando unas tijeras curvas estériles.
5. Transfiera los pañuelos picados a un nuevo tubo de 50 mL que contenga 25 mL de medio de lavado.
6. Centrifugar la muestra a 500 x g durante 15 min a 4 °C.
7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los pellets en 10 mL de medio de lavado que contiene colagenasa (100 U/mL) y DNasa (0.1 mg/mL).
8. Permita que los tumores picados se digieran en una incubadora a 37 °C con agitación lenta (50 rpm) durante 1,5 h.

2. Cultivo de SBNETs como esferoides tumorales en Matriz Extra Celular (ECM)

1. Una vez completada la digestión (paso 1.8), centrifugar a 500 x g durante 15 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 15 mL de medio de lavado.
2. Coloque un filtro de células de 70 μm encima de un nuevo tubo de 50 mL y transfiera 10 mL del medio de lavado sobre el filtro de células. Agite el medio de lavado para cubrir el costado del tubo de plástico y evitar que las células NET se peguen al costado del tubo de plástico.
3. Filtra la suspensión de celdas a través de un filtro de celdas.
4. Centrifugar a 500 x g durante 15 min a 4 °C, desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 200 μL de medio de lavado (el volumen total es ~ 250 μL) y colocarlo en hielo.
5. Transfiere 5 μL de células a 500 μL de medio de lavado (factor de dilución 1/100). Utilice las células diluidas para el recuento de células utilizando un hemocitómetro para obtener el número de células por mililitro. Multiplique por 100 para corregir el factor de dilución.
6. Multiplique el número de células por mL obtenido en el paso 2.5 por el volumen total de células en suspensión obtenido en el paso 2.4 (~ 250 μL).
7. Centrifugar a 500 x g durante 15 min a 4 °C, desechar el sobrenadante, y resuspender las células en ECM líquida (1 x 10⁶ cells/mL), y mantener en hielo.
8. Transfiera 5-20 μL de esferoides SBNET en ECM a una placa de 96 pocillos y permita que el ECM líquido se solidifique colocando la placa en una incubadora a 37 °C durante 5 min.
9. Agregue 200 μL de medio de cultivo SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamina + 10 mM de nicotinamida + 10 μg/mL de insulina) a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene los esferoides SBNET en ECM.
10. Alternativamente, cultive organoides SBNET en medios de células madre similares a los que se han descrito anteriormente para cultivar hígado humano u organoides pancreáticos y enumerados en la Tabla de Materiales.
11. Cambia los medios cada 5-7 días.

3. Caracterización de esferoides SBNETS por inmunofluorescencia

1. Transfiera los organoides cultivados en ECM a un tubo de 1,5 mL utilizando una pipeta P1000.
2. Centrifugar a 1.500 x g durante 1 min y eliminar el sobrenadante.
3. Lave el cultivo de organoides añadiendo 1 mL de solución salina tampón de fosfato o PBS, mezcle, centrifugue a 1.500 x g durante 1 min y retire el sobrenadante.
4. Fija los organoides añadiendo 500 μL de paraformaldehído al 4% e incuba durante 15 min.
5. Lave el cultivo dos veces con 1 mL de PBS.
6. Permeabilice el cultivo añadiendo 500 μL de PBS + 3% de albúmina sérica bovina o BSA + 0.1% Triton X 100 durante 5 min.
7. Luego, lava tres veces con 1 mL de PBS + 3% BSA.
8. Incubar durante 1 h con anticuerpos primarios contra sinaptofisina (SYP) en dilución 1/600 o cromogranina A (CgA) y receptor de somatostatina 2 (SSTR2) en dilución 1/400 en tampón de anticuerpos (2,5% albúmina sérica bovina, 0,1% azida sódica, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM cloruro sódico).
   NOTA: Utilice 300 μL o más de solución de anticuerpos por tubo.
9. Lavar tres veces con 1 mL de PBS + 3% BSA.
10. Incubar con anticuerpos secundarios acoplados a FITC en dilución 1/500 en tampón de anticuerpos durante 1 h. Utilice 300 μL o más de solución de anticuerpos por tubo.
11. Lavar 3 veces con 1 mL de PBS + 3% BSA. Asegúrate de aspirar y desechar todo el sobrenadante.
12. Añade 5 μL de medio de montaje que contenga la tinción nuclear DAPI.
13. Utilice una pipeta P20 para transferir 5 μL de los esferoides SBNET del paso 4.12 a un portaobjetos de vidrio y selle con un cubreobjetos.
14. Toma imágenes usando un microscopio fluorescente usando los objetivos 10x, 20x o 40x.

Materiales