Medición de la tasa de consumo de oxígeno en cortes agudos de cerebro de ratón

Resumen

Fuente: Zhi, L. et al., Medición de la tasa de consumo de oxígeno en cortes estriados agudos de ratones adultos. J. Vis. Exp. (2022).

Este video demuestra cómo medir la tasa de consumo de oxígeno mitocondrial (OCR) en cortes de cerebro estriado de ratón. En él se detallan los pasos para preparar la placa de tejido y el cartucho del sensor, cargarlos en el analizador de flujo, y se explican los procesos celulares que subyacen a los patrones de OCR.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Sensores de cartucho de hidrato (1 día antes del ensayo)

1. Abra el kit de ensayo de flujo extracelular (consulte la Tabla de Materiales) y retire tanto el cartucho del sensor (verde) como la placa de utilidad (transparente; Figura 1A). Coloque el cartucho del sensor a un lado (sensores arriba) y no toque los sensores.
2. Agregue 600 μL de solución calibrante (pH 7.4) a cada pocillo de la placa de utilidad. Coloque el cartucho del sensor encima de la placa multiusos y sumerja los sensores en la solución del calibrador. Asegúrese de que la muesca triangular de la placa del cartucho de la utilidad y del sensor esté correctamente alineada (Figura 1B).
3. Selle el kit de ensayo de flujo extracelular con una película de sellado para evitar la evaporación de la solución calibrante, y luego colóquelo en una incubadora a 37 °C no suplementada con CO₂ u oxígeno durante la noche.

2. Prepare la placa de tejido (el día del ensayo)

1. Abra la microplaca de captura de islotes y saque la placa de islotes para sentar el tejido.
2. Calienta un volumen adecuado (625 μL por pocillo) de líquido cefalorraquídeo artificial modificado preoxigenado (ACSF, composición 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 25 mM glucosa, 10 mM HEPES, pH 7,2) a 37 °C en un tubo de 50 mL. A continuación, añada BSA hasta una concentración final de 4 mg/mL para preparar el tampón respiratorio. En general, 50 ml son suficientes para una placa.
3. Agregue 625 μL de tampón de respiración (tampón ACSF preoxigenado con 25 mM de glucosa y 4 mg/mL de BSA) a cada pocillo de la placa del islote con cuidado y evite agitar la placa. Asegúrese de que no haya gotas residuales en la parte superior del cartucho del sensor y que no haya burbujas de aire en el tampón de cada pozo.

3. Preparación aguda de cortes estriados y colocación

1. de cortes extirpadosDecapitar al ratón después de la dislocación cervical e inmediatamente diseccionar el cerebro en 10 mL de solución de corte preoxigenada helada (125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO₃, 3,7 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM de glucosa, pH 7,4).
2. Section coronal estriada con un vibratomo siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales) a un espesor de 150 μm en una solución de corte preoxigenada y helada.
3. Recupere las rodajas en 50 mL de ACSF oxigenado (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2.4 mM CaCl₂, 1.3 mM MgSO₄, 0.3 mM KH₂PO₄, 10 mM glucosa, 2 mM HEPES, pH 7.4) y manténgala en solución hasta 30 min a temperatura ambiente (RT).
4. Después de la recuperación, transfiera las rodajas a una placa de Petri de 35 mm x 10 mm con 5 mL de tampón de respiración.
5. Utilice un punzón de biopsia de acero inoxidable (por ejemplo, de 1,5 mm de diámetro) para crear una pieza circular de tejido en el área deseada del cerebro cortado. Mantenga la rebanada en el tampón mientras presiona suavemente con el punzón. Asegúrate de que el punzón se empuje hacia abajo lo suficientemente fuerte como para cortar el tejido. Retire el resto del pañuelo, levante el punzón y retire la pieza circular de tejido en el tampón.
6. Corta el extremo de una punta de pipeta de 1 mL para hacer un agujero con un diámetro de 1,5-2,0 mm y úsalo para sujetar y transferir la rebanada perforada a la parte superior de la pantalla de captura. Succiona una pieza de tejido cerebral perforado y coloca cuidadosamente el tejido en el lado de la malla de la pantalla de captura (Figura 2A). La pantalla de captura será una pieza circular de plástico con la malla unida a un lado.
   NOTA: Las pantallas de captura están incluidas en el paquete de microplacas (ver Tabla de Materiales).
7. Usa suavemente un pañuelo de papel para secar brevemente la pantalla de captura. Con la humedad eliminada, el tejido se vuelve pegajoso, lo que permite que la rebanada se adhiera al centro de la malla. No seque demasiado la rebanada, ya que de lo contrario se dañará.
8. Sostenga la pantalla de captura con las pinzas y colóquela en uno de los pocillos de la placa del islote de incubación (Figura 2B). Tenga cuidado de no dejar caer la rebanada; Si es así, saque la pantalla y coloque una nueva porción sobre ella.
   NOTA: No coloque cortes de cerebro en los dos pozos de corrección de fondo (A1 y D6) en la placa del islote.
9. Incube la placa de islotes a 37 °C en una incubadora durante al menos 30 min para permitir el equilibrio de temperatura y pH antes de ejecutar el ensayo.

4. Carga de cartuchos con los compuestos deseados

1. Diluya los compuestos deseados en ACSF modificado (37 °C) hasta la concentración final de 10x, 11x, 12x y 13x de la concentración de trabajo para los puertos A a D, respectivamente, y ajuste a pH 7.4. La prueba administrará los compuestos en orden del puerto A al D. Para este experimento se utilizaron las siguientes soluciones, con sus respectivas concentraciones de trabajo mencionadas anteriormente: 10 mM de piruvato (puerto A), 20 μM de oligomicina (puerto B), 10 μM u otras concentraciones de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) (puerto C) y 20 μM de antimicina A (puerto D).
2. Precargue suavemente 75 μL de los compuestos diluidos en los puertos de inyección apropiados del cartucho del sensor. Coloque las puntas hasta la mitad de los puertos de inyección en un ángulo de 45° con la punta contra la pared del puerto de inyección. Las puntas no deben insertarse completamente en la parte inferior de los puertos de inyección, ya que esto puede causar fugas de compuesto a través del puerto.
3. Retira las puntas de los puertos con cuidado para evitar crear burbujas de aire. No golpee ninguna parte del cartucho para evitar aliviar las burbujas de aire.
4. Inspecciona visualmente los puertos de inyección para una carga uniforme. Asegúrese de que todo el líquido esté en el puerto y que no haya gotas residuales en la parte superior del cartucho.
5. Coloque el cartucho del sensor en la placa de utilidad y colóquelo en una incubadora (sin CO₂) durante 30 min para permitir que se caliente hasta 37 °C nuevamente. Manéjelo con cuidado sosteniendo solo la placa utilitaria. Muévete lo menos posible.

5. Calibración y realización del ensayo

1. Cargue la plantilla de ensayo en el software. Presione el botón verde START.
2. Asegúrate de cargar el protocolo correcto. El protocolo contiene una combinación de secuencias de mezcla de 3 minutos, 3 minutos de espera y 2 minutos de medición (estos tres pasos forman una medición). Cambie la distancia del cabezal de la sonda de 26.600 a 27.800 en la configuración de hardware en la configuración del instrumento. No es necesario cambiar el cabezal de la sonda para el analizador XFe24. Presione INICIO.
3. Cargue el cartucho del sensor en la placa de utilidad en la bandeja de instrumentos. La muesca va en la esquina delantera izquierda. Asegúrese de que la placa se asiente correctamente y esté plana. Cargue el cartucho del sensor lleno de fármaco en el analizador para la calibración.
4. Siga las instrucciones en pantalla para calibrar y equilibrar los sensores. Esto tarda alrededor de 30 min.
5. Una vez realizado el paso de calibración, retire la placa de calibración y reemplácela con la placa del islote (que contiene la malla y las rodajas de tejido).
6. Mida el consumo de oxígeno en cada pocillo de la placa utilizando los protocolos de ensayo. El protocolo contiene una combinación de secuencias de mezcla de 3 minutos, 3 minutos de espera y 2 minutos de medición (estos tres pasos forman una medición), momento en el que se calcula la tasa de consumo de oxígeno (OCR).
7. Para todo el experimento, incluya 4 mediciones de OCR para crear una línea de base, seguidas de la inyección del puerto A (piruvato) con 4 mediciones, luego la inyección del puerto B (oligomicina) con 8 mediciones, luego la inyección del puerto C (FCCP) con mediciones 5x y, finalmente, la inyección del puerto D (antimicina A) con mediciones 6x.
   NOTA: Este número de mediciones después de cada inyección de compuesto se determina dependiendo de cuándo la medición alcanza la meseta.
8. Analice los datos de medición de OCR y los datos de eficiencia de acoplamiento.

Resultados

Figura 1: Imágenes que muestran los sensores y la placa del cartucho de hidrato del analizador de flujo extracelular. (A) El cartucho del sensor se encuentra encima de una placa de calibración (placa utilitaria). (B) Vis...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Accumet AB150 medidor de sobremesa de pH	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	To measure pH
Antimicina A de Streptomyces sp.	SIGMA	A8674	Para inhibir el complejo III de las mitocondrias
Albúmina sérica bovina (BSA)	SIGMA	A6003	To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)
Carbonyl cyanude 4-( trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP)	SIGMA	C2920	Para desacoplar la respiración mitocondrial
D-Glucosa	SIGMA	G8270	Para hacer líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	Para hacer líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF)
Incubadora humidificada de dióxido de carbono	Fisher Scientific	11-683-230D	Para hidratar placas a 37 °C
Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	Para inhibir la ATP sintasa mitocondrial
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Solution for seahorse calibration
Seahorse XF Analizador de Flujo Extracelular	Seahorse Bioscience		Equipo utilizado para analizar la tasa de consumo de oxígeno, generación antigua
Seahorse XFe24 Analizador de Flujo Extracelular	Seahorse Bioscience		Equipo utilizado para analizar la tasa de consumo de oxígeno, new generation
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Paquete de cartuchos de sensores de analizador de flujo, placas de cultivo de tejidos, pantallas de captura, solución de calibrante y placas de calibración; kit de ensayo.
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	Para evitar cualquier restricción limitante del sustrato del suministro de sustrato
Punzones de biopsia de acero inoxidable	Miltex		Dispositivo utilizado para perforar cortes
Plato de cultivo celular estéril, 35 x 10 mm	Eppendrof	30700102	Used for slice punch
Vibratome	Leica	VT1200	To slice brain tissue
baño de agua	Thermo Scientific Precision	282-115	Para calentar el tampón y las soluciones