Generación de un modelo de rata de la transposición del neuroma tibial

Resumen

Fuente: Brakkee, E. M., et al. Cirugía y pruebas conductuales en el modelo de transposición del neuroma tibial en ratas. J. Vis. Exp. (2023).

Este video muestra un procedimiento para generar un modelo de transposición de neuroma tibial (TNT) en ratas. Después de exponer el nervio tibial en la pata trasera de una rata anestesiada, transecte el nervio. A continuación, crea un túnel subcutáneo, pasa el nervio cortado a través del túnel y sutura en su lugar. En ausencia de un objetivo para la reinervación, las excrecencias axonales desorganizadas del nervio cortado forman un neuroma, que desencadena dolor neuropático al excitar los nociceptores.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Anesthesia and preparation

NOTA: Este estudio se realizó en 15 ratas macho Sprague Dawley de 12 semanas de edad.

1. Anestesiar a los animales por inducción con isoflurano al 5% y mantener la anestesia con isoflurano al 2%-3%.
   NOTA: El mantenimiento con isoflurano al 2% generalmente resulta en suficiente anestesia y respiración espontánea, sin necesidad de intubación traqueal o ventilación mecánica.
2. Comprueba los reflejos de los animales pellizcando el pie con unas pinzas. Asegúrese de que el animal no responda antes de continuar. Afeitar el campo operatorio desde la rodilla hasta el tobillo con una afeitadora eléctrica y aplicar ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la sequedad. Inyectar 0,5 mg/kg de carprofeno analgésico por vía subcutánea en la región abdominal.
3. Coloque a la rata anestesiada boca arriba con la cabeza hacia la izquierda o hacia la derecha y la pata a operar cerca del cirujano. Exrotar la extremidad posterior inferior de modo que el maléolo medial mire hacia arriba. Coloque la rata bajo un microscopio quirúrgico estereoscópico con un aumento de 6x.
4. Desinfecta el área afeitada con tres rondas alternas de exfoliante a base de yodo seguidas de alcohol. Coloque una lámina estéril con un orificio quirúrgico sobre la pierna, de modo que solo se vea el campo operativo. Asegúrese de mantener estas condiciones estériles durante la cirugía.

2. Surgery

1. Coloque un pequeño bastoncillo de algodón debajo del tobillo para mantener el campo operatorio horizontal. Localice la rodilla y haga suavemente una incisión longitudinal de 1-2 cm con un bisturí sobre el lado medial de la pata trasera desde la mitad de la pantorrilla hasta el tobillo. Si es necesario, abra la piel y subcutis aún más con microtijeras hasta que las capas musculares sean visibles.
2. Identifica el haz neurovascular superficial como dos o tres líneas blancas y una línea púrpura/roja más gruesa, a veces con ramas menores, que pueden moverse libremente sobre las capas musculares. Usando un electrocauterio (ver Tabla de Materiales), coagule cualquier sangrado activo o supuración en el campo operatorio. Tenga cuidado de no dañar el haz neurovascular.
3. Disecciona sin rodeos para abrir la fascia entre los músculos gastrocnemio, justo después del haz neurovascular superficial de 2.2. Entre la fascia de los músculos, se encuentra el nervio tibial. El nervio tibial es aproximadamente tres veces el tamaño del nervio superficial en el haz neurovascular. Use el hueso tibial como un punto de referencia adicional (el nervio tibial se encuentra justo después del hueso tibial).
4. Identifica el nervio tibial y su bifurcación.
   NOTA: La bifurcación suele ser visible con una línea más clara longitudinalmente sobre el nervio.
5. Disecciona cuidadosamente el nervio tibial libre de los haces vasculares circundantes. Realice la disección moviendo sin rodeos el nervio tibial y cortando el tejido expuesto que muestra algo de estiramiento mientras mueve el nervio tibial.
   NOTA: Si el nervio tibial se une a las venas cruzadas después de la disección, estas venas pueden coagularse para exponer todo el nervio tibial. Tenga cuidado de no coagular el haz tibial en sí.
6. Exponga el nervio tibial proximalmente hasta que desaparezca debajo de una capa de músculo cruzado. En este punto, el nervio tibial parece sumergirse más profundamente en la pata trasera hacia la rodilla. Exponga el nervio tibial distalmente hasta el tobillo.
   NOTA: Cuando el nervio tibial se expone más distalmente, la cantidad de fibras de colágeno cruzadas (es decir, fibras perpendiculares a la dirección de las fibras nerviosas) aumentará. Estas fibras de colágeno deben cortarse para permitir la longitud suficiente para la transposición del nervio tibial.
   1. Cuando todo el nervio tibial esté expuesto, coloque las capas musculares hacia atrás para evitar la deshidratación del nervio. Si el nervio se deshidrata (es decir, se vuelve más rígido, opaco y arrugado) y no es suficiente cubrirlo con capas musculares, agregue gotas de solución salina para hidratarlo.
7. Utilizando una herramienta de microcirugía roma, preferiblemente un micro portaagujas, diseccione la piel pretibial de la capa muscular subcutánea para hacer un túnel subcutáneo. Para hacer esto, sostenga la piel hacia arriba y empuje la punta roma hacia el tejido, paralela a la piel. Asegúrese de que el final del túnel esté ubicado pretibialmente o más lateralmente para garantizar un fácil acceso al área para la prueba del neuroma.
8. Aumenta el isoflurano al 5%. Regrese al nervio tibial y expóngalo (es decir, regrese al lugar descrito en el paso 2.6). Corta el nervio tibial (es decir, ambas ramas plantares) en el nivel más distal, cerca del tobillo. Disminuya el isoflurano al nivel normal de 2%-3%.
9. Cambie el aumento del microscopio a 10x o 16x. Identifique el epineurio del nervio tibial proximal al corte realizado en el paso 2.8, o en caso de una bifurcación más proximal del nervio tibial, identifique el epineurio de las ramas plantares medial y lateral proximales al corte en el paso 2.8.
   NOTA: El epineuro es más blanco y firme en comparación con las fibras nerviosas internas, que son más amarillas y suaves.
10. Coloca cuidadosamente un 8-0 Sutura de nylon (ver Tabla de Materiales) a través del epineuro del extremo nervioso proximal sujetando cuidadosamente el epineuro con pinzas y colocando la aguja entre el nervio y el epineuro con una mordida de aproximadamente 0,5 mm. Tire de la sutura y muerda la aguja por vía subcutánea al final del túnel subcutáneo realizado en el paso 2.7. Haz un nudo, que transpondrá el nervio lateralmente al túnel subcutáneo.
    NOTA: Si ambas ramas plantares comparten un epineuro común, una sutura debería ser suficiente. Si ambas ramas plantares tienen su propio epineuro, cada epineuro debe fijarse individualmente. Evite colocar la sutura a través de la piel; solo arréglalo por vía subcutánea.
11. Coloque una sutura más gruesa con un color oscuro (preferiblemente una sutura 4-0 azul o negra) al ras del extremo nervioso fijado, sin penetrar en la piel. Asegúrese de que la sutura sea visible desde el exterior de la piel. Compruebe si el nervio permanece en su lugar después de mover la pata y los músculos. Corte los extremos de la sutura con un extremo de sutura ligeramente más largo en el 4-0 que en el 8-0 sutura.
12. Cambia el aumento del microscopio a 6x. Cierra la piel con suturas intraepidérmicas usando el 8-0 sutura y limpie suavemente la piel con NaCl al 0,9% con un bastoncillo de algodón.

3. Post-surgical treatment

1. Coloque a la rata en una jaula limpia debajo de una toalla de papel en una posición cómoda. Si la habitación es fría, coloque una almohadilla térmica debajo de una parte de la jaula (solo debajo de una parte de la jaula, ya que el animal debe poder escapar del calor cuando sea necesario). Garantizar un fácil acceso a los alimentos y al agua.
2. No deje a la rata postquirúrgica desatendida hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. La rata puede ser devuelta a la compañía de otros animales cuando se haya recuperado completamente de la anestesia después de la cirugía. Esto suele ocurrir después de 1 hora y cuando la rata exhibe su patrón de marcha y comportamiento normales.
3. A las 24 h y 48 h después de la cirugía, administre una dosis de 0,5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea (región abdominal) para tratar el dolor postquirúrgico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Carprofen	Local Veterinary Pharmacy	n/a	La farmacia veterinaria local fabrica la dilución
Cotton swabs	Nobamed	974255
Electrocauterio	Fine Science Tools	18010-00
Ethanol 70%	Interchema BV	400406
Ethilon 4.0	Johnson & Johnson	1854G	IMPORTANTE: el color debe ser azul o negro
Ethilon 8.0	Johnson & Johnson	BV130-5
Isoflo, isoflurano Zoetis<	B506
Mesh bottom cages	StoeltingCo	57816 and 57824
Micro fórceps	Fine Science Tools	11251-35
Micro needle holder	Fine Science Tools	12076-12
Micro scissors	Fine Science Tools	15019-10
Micro pinzas	Fine Science Tools	11254-20
NaCl 0.9%	Trademed	H7 1000-FRE
Needle holder	Fine Science Tools	12004-16
Ophthalmic ointment	Local Veterinary Pharmacy	n/a	La farmacia veterinaria local fabrica el ungüento
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scissors	Fine Science Tools	14001-12
Stereo surgical microscope	Leica	A60 F
Sili-ster with hole		1555-01
Cuchilla quirúrgica nr.15	Fine Science Tools	10015-00
Tweezers	Fine Science Tools	11617-12

de caprofenotd style='border-left-style:none;border-top-style:none;'>Dechra Veterinary Products oftálmico