Desarrollo de un modelo experimental de aneurisma en un conejo utilizando una bolsa vascular tratada con elastaso

Resumen

Fuente: Wanderer, S., et al. Modelo de aneurisma de bifurcación microquirúrgica con bolsa arterial en conejo. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra la creación de un modelo experimental de aneurisma en un conejo utilizando una bolsa de recipiente tratada con elastasa. Después de extirpar un segmento del CCA derecho, la bolsa se trata con elastasa y luego se sutura al CCA izquierdo para restaurar el flujo sanguíneo. La tensión resultante en las paredes debilitadas de la bolsa induce la formación de aneurismas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

NOTA: Aloje a todos los animales a una temperatura ambiente de 22\u201224 Celsius (°C) y mantenga un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (h). Proporcione acceso gratuito a agua, pellets y heno ad libitum en todo momento. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba no paramétrica Wilcoxon-Mann-Whitney-U. Se consideró significativo un valor de probabilidad (p) de ≤ 0,05.

1. Fase

1. prequirúrgicaRealice un examen clínico preoperatorio detallado de todos los conejos planeados para cirugía inmediatamente al lado de un quirófano tranquilo y aséptico, manteniendo una temperatura de 23 ± 3 °C.
   1. Registre macroscópicamente el peso de cada animal y evalúe las membranas mucosas, el tiempo de llenado capilar y la calidad del pulso.
   2. Más adelante, realice la auscultación cardíaca con un estetoscopio y palpación abdominal.
   3. Basándose en los hallazgos clínicos, atribuye una clasificación de la Sociedad Americana de Anestesiólogos (ASA) a cada conejo19. Incluya solo animales con una puntuación ASA I en el estudio.
   4. Afeita ambas orejas externas con una afeitadora eléctrica y aplica crema de prilocaína-lidocaína en ambas arterias y venas auriculares.
2. Separa al conejo con una combinación de 20 miligramos (mg)/kilogramo (kg) de ketamina, 100 mg/kg de dexmedetomidina y 0,3 mg/kg de metadona inyectada por vía subcutánea (SC) a través de una jeringa.
3. Deja a cada animal sin molestar durante al menos 15 min.
4. Después de eso, bajo oxigenación suplementaria con 3 litros (l) /minuto (min) a través de una mascarilla facial suelta y monitoreo constante a través de un oxímetro de pulso, coloque una cánula de 22 G en la arteria central auricular izquierda y otra cánula de 22 G en la vena auricular del oído contralateral.
5. Afeita el campo quirúrgico (cuello) e inyecta ropivacaína periincisional al 0.75% por vía intradérmica. A continuación, aféitese la frente y prepárese para colocar sensores electroencefalográficos (EEG) pediátricos.
6. Inducir anestesia general con propofol 1-2 mg/kg por vía intravenosa (IV) para efectuar. Luego, intubar inmediatamente la tráquea de todos los conejos con un tubo de silicona (3 milímetros (mm) de diámetro interno) bajo control capnográfico. Después, transporta a todos los conejos al quirófano, colócalos en decúbito dorsal y conecta el tubo a un sistema de círculos pediátricos.
7. Logre la profundización y el mantenimiento de la anestesia a través del isoflurano en oxígeno, apuntando a una concentración máxima de isoflurano al final de la espiración de 1.3%.
8. Asegure la monitorización clínica e instrumental (oximetría de pulso, doppler y presión arterial invasiva, electrocardiograma de 3 derivaciones, EEG, monitorización de la temperatura rectal y gases inhalados y exhalados) hasta la extubación traqueal.
9. Para mantener la hidratación, el lactato de Ringer se proporciona a una infusión de tasa continua (CRI) de 5 ml/kg/h a través del acceso venoso. Siempre confirme la anestesia adecuada usando pinzamientos en los dedos de los pies a un intervalo de 10 minutos.
10. Desinfecte el campo quirúrgico con povidona yodada desde el manubrium sterni hasta ambos ángulos de la mandíbula. Ahora, realice un drapeado estéril del campo quirúrgico.
11. Durante la cirugía, proporcionar analgesia con lidocaína a un CRI de 50 microgramos (μg)/kg/min y fentanilo a 3\u201210 μg/kg/h. Aplicar ventilación espontánea o asistida, así como hipercapnia permisiva. Realizar análisis de gases arteriales al menos una vez durante la cirugía.
12. Trata la hipotensión relevante (presión arterial media < 60 mmHg) con noradrenalina. Evite la hipotermia (temperatura rectal ≤ 38 °C) utilizando una almohadilla térmica o un sistema de calentamiento por aire forzado.

2. Fase quirúrgica – Paso I

1. Comience la cirugía con una incisión cutánea mediana desde el manubrium sterni hasta el nivel de los ángulos de la mandíbula/laringe. Diseccione bruscamente la piel y los tejidos blandos con un bisturí, tijeras quirúrgicas y fórceps. Separe el subcutis y la almohadilla de grasa medialmente mediante una disección roma.
2. Ingrese a la cresta superior anterior del músculo esternocleidomastoideo medialmente en el lado izquierdo mediante disección roma usando micro pinzas y tijeras quirúrgicas.
3. Macroscópicamente, realice una preparación contundente y separe cuidadosamente el CCA izquierdo del nervio vago distalmente para evitar la paresia laríngea mediante el uso adicional de micropinzas y tijeras quirúrgicas (Figura 1). Nótese que la bifurcación del CCA izquierdo sirve como hito intraoperatorio (Figura 2 y Figura 3A). Para todos los pasos siguientes, use un esparcidor de tejido blando para mejorar la visualización quirúrgica.
4. Después de una preparación y liberación exitosas del CCA distal izquierdo del nervio vago, administre papaverina (40 mg/ml, 1:1 diluido en una solución de cloruro de sodio isotónico al 0,9%) localmente. Proteja continuamente todos los segmentos de los vasos con microhisopos seguidos de una administración adicional de papaverina externa. Coloque el CCA izquierdo empapado en papaverina debajo del tejido muscular autólogo para proteger el vaso de la desecación bajo la luz del microscopio de operación.
5. Cambia de lado mientras maximiza la comodidad del cirujano durante el procedimiento operatorio. Repita el mismo procedimiento quirúrgico en el lado derecho. Diseccionar la ACC distal y proximalmente hasta los puntos de referencia predefinidos (bifurcación carotídea a nivel de los ángulos de la mandíbula/laringe y la vena yugular interna; Figura 3A,B). Vuelva a insertar un esparcidor y administre microhisopos y papaverina como se describió anteriormente.
6. Antes de la ligadura del ACC proximal derecho, inyecte heparina (500 unidades internacionales (UI)/kg) sistémicamente a través de un catéter de oído venoso.
7. Utilice un microscopio quirúrgico a partir de ahora. En primer lugar, ligar el ACCA proximal derecho con una sutura no absorbible 4-0 directamente en el extremo del punto de referencia proximal macroscópicamente visible para evitar cualquier tensión en el vaso arterial.
   1. En segundo lugar, aplique una ligadura no absorbible 6-0 exactamente 4\u20125 mm distalmente utilizando un clip de vaso para la medición, considerando que después de cortar distalmente desde la primera ligadura 4-0, la bolsa arterial resultante tendrá una longitud estandarizada de aproximadamente 3\u20124 mm en cada animal (Figura 4A,C).
8. Después de apretar la ligadura 6-0, sujete el CCA derecho lo más distalmente posible con un clip de vaso temporal (como normalmente se usa en la cirugía de aneurismas cerebrales) para evitar cualquier daño endotelial y crear un segmento de vaso largo para la irrigación con el fin de prevenir trombogénesis (Figura 4B).
9. Ahora realiza un corte distalmente a la ligadura 4-0 no absorbible. Para extraer la bolsa arterial (Figura 4C), realice un segundo corte distal a la ligadura 6-0 no absorbible.
10. Limpie meticulosamente la bolsa arterial de todo el tejido blando y mida su longitud, anchura y profundidad (Figura 4C) con una pinza para el vaso. Si no es necesaria ninguna modificación adicional, mantener el injerto arterial autólogo en una solución heparinizada (500 UI/100 ml en cloruro de sodio isotónico al 0,9%) a temperatura ambiente hasta su uso posterior.

3. Degradación de la bolsa arterial

1. Si se necesita una degradación de la bolsa arterial, límpiela meticulosamente de tejido blando y preincube con 100 UI de elastasa porcina disuelta en 5 ml de Tris-buffer a temperatura ambiente el día del experimento durante 20 min. No utilices una técnica de pincel. Incubar la bolsa arterial intra y extraluminalmente mediante el uso de un agitador.
2. Antes de poner la bolsa en una solución heparinizada de cloruro de sodio isotónico al 0,9%, deslícela suavemente tres veces durante 3 minutos con pinzas anatómicas en una solución de cloruro de sodio isotónico al 0,9% para lavar la elastasa porcina restante.
3. Si es necesario, mantenga el lumen de la bolsa arterial abierto con un microtubo hecho de silicona; proteja meticulosamente el CCA izquierdo y derecho durante todo el procedimiento quirúrgico con micro acolchados húmedos.

4. Fase quirúrgica – Paso II

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1. span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>Para una mayor preparación del CCA, coloque dos micro hisopos redondos directamente debajo de él para mover la arteria más superficialmente. Ahora, coloque un micro hisopo con relleno púrpura debajo del CCA izquierdo en el tercio distal para una mejor visualización de la arteria.
2. Enjuague el CCA proximal derecho con una solución de cloruro de sodio isotónico al 0,9% combinado con 500 UI de heparina disuelta en 100 ml de cloruro de sodio isotónico al 0,9%. Para crear una anastomosis sin tensión, coloque el CCA derecho debajo de la almohadilla de grasa/musculatura peritraqueal utilizando tijeras quirúrgicas para tunelizarlo hacia el lado izquierdo. Extirpar el tejido blando de la arteria.
   1. Ahora realice una incisión de boca de pez de 2 mm en el lado proximal del CCA derecho utilizando una micro tijera y pinzas.
3. Cambia el lado de la mesa de operaciones. Recorte el CCA distal izquierdo con otro clip de vaso temporal seguido de el CCA proximal izquierdo con dos clips de vaso temporales. Proteja todos los segmentos de vasos expuestos para que no se sequen bajo la luz quirúrgica con microhisopos húmedos.
4. Libera completamente el tercio distal del CCA izquierdo del tejido blando y realiza una arteriotomía. Use micropinzas quirúrgicas y agarre suavemente algunos tejidos blandos. Ahora eleve la arteria e incida lentamente en el CCA distal izquierdo con una tijera quirúrgica. Lavar los segmentos del vaso con heparina (500 UI disueltas en 100 ml de solución de cloruro sódico isotónico al 0,9%).
5. Después de realizar la arteriotomía con micro pinzas curvas y micro tijeras, agrandar distalmente la arteriotomía ubicada en el tercio distal del CCA izquierdo, midiendo aproximadamente 2 veces el diámetro del romo derecho de la arteria carótida y el injerto autólogo. Esto permite un flujo sanguíneo suficiente hacia la bolsa arterial.
6. Saca la bolsa arterial de la solución salina heparinizada. Coloque la bolsa en el campo quirúrgico, donde se planea la bifurcación. Comience a suturar la parte posterior de la carótida derecha roma situada caudalmente con una sutura 9-0 no absorbible, seguida de una sutura en la parte posterior localizada cranealmente a nivel de la incisión de la boca del pez. Termina de coser la parte trasera de distal a proximal mediante puntos sencillos.
7. Mientras sutura, mantenga húmedas todas las bolsas preincubadas de elastasa con irrigación continua. Mientras sutura la pared del vaso de la bolsa, use micropinzas quirúrgicas curvas para abrir suavemente el lumen con su punta. Siempre que suturen partes del CCA izquierdo o proximal derecho, utilice micropinzas quirúrgicas rectas. A continuación, sutura la parte trasera horizontal.
8. Siguiente sutura la cara frontal horizontal, comenzando en la cúpula del aneurisma moviéndose hasta su base. A continuación, comienza con puntos sueltos distalmente en la parte delantera moviéndote caudalmente.
   1. Para todos los pasos 4.5\u20124.8 mientras sutura la anastomosis, preste atención solo para agarrar la parte del vaso cerca de la arteriotomía para evitar la estenosis iatrogénica. Además, humedecer continuamente todos los segmentos de los vasos durante todo el procedimiento quirúrgico extraluminalmente con una jeringa llena de solución de cloruro de sodio heparinizado (500 UI disueltos en 100 ml de cloruro de sodio isotónico al 0,9%) y protegerlos con microhisopos húmedos.
   2. Antes de terminar la anastomosis, irrigar todo el complejo con una solución de cloruro de sodio isotónico al 0,9% heparinizada intraluminal (500 UI disueltas en 100 ml de cloruro de sodio isotónico al 0,9%). Tenga en cuenta que las bolsas arteriales modificadas con elastaso deben coserse lo más rápido posible debido a su fuerte tendencia a secarse y trombose. Debido al comportamiento agresivo de la concentración residual de elastasa en la bolsa con respecto a la digestión de los vasos circunferenciales, se debe proceder rápidamente con la cirugía para volver a perfundir el complejo de vasos rápidamente.
9. Retire todas las pinzas vasculares temporales paso a paso.
   1. Retire la pinza distal del CCA izquierdo. Acepte el sangrado leve y deténgalo imprimiendo suavemente microhisopos en la anastomosis. A continuación, retire la pinza del CCA derecho, presione suavemente con un microhisopo y unas pinzas para evitar la formación de trombos.
   2. Si es necesario, reemplace los clips vasculares temporales para proporcionar suficiente coagulación. A continuación, alivie ambos clips de vasos desde el lado izquierdo proximalmente. Si es necesario en cualquier paso, reemplace los clips para permitir la coagulación o para volver a coser.
10. En esta etapa realice una angiografía de fluorescencia del complejo de vasos (Figura 5)
    NOTA: La angiografía por fluorescencia se realiza administrando 1 ml de fluoresceína IV, utilizando 2 filtros de paso de banda, un teléfono inteligente con cámara de video y un foco de bicicleta. Este procedimiento ya ha sido descrito en otro lugar20,21,22.
11. Por último, cierre el lugar operatorio. Readapte y suture suavemente la almohadilla de grasa con una sutura reabsorbible 3-0 con un solo nódulo para proteger la anastomosis. Cierra el subcutis y la piel de la misma manera.

5. Fase

1. postquirúrgicaSuspender la administración de isoflurano y analgesia sistémica al final de la cirugía y realizar la extubación traqueal tan pronto como el reflejo de deglución haya regresado.
2. Administre 0.5 mg/kg de meloxicam IV, 10 mg/kg de aspirina (ASS) IV, 100 μg de vitamina B12 SC y 20 mg/kg de clamoxyl IV.
3. Proporciona oxigenación suplementaria y calentamiento activo hasta que los conejos hayan recuperado espontáneamente la decúbito esternal.
4. Realice el seguimiento postoperatorio y el cuidado de los animales cuatro veces al día durante los primeros tres días de acuerdo con las directrices para la evaluación y el manejo del dolor en roedores y conejos23,24.
5. Administre analgesia postoperatoria a través de un parche de fentanilo (12 μg/h) aplicado en el oído externo, meloxicam una vez al día SC durante tres días y metadona como terapia de rescate SC, según la hoja de puntuación para la evaluación del dolor. Administrar 250 UI/kg de heparina de bajo peso molecular (LMH) por vía subcutánea durante tres días en todos los conejos.

Resultados

Figura 1: Paso operativo inicial.

Paso operatorio inicial, que representa la arteria carótida izquierda (flecha blanca), el nervio vagal (flecha negra) (A) y la separación cuidadosa de la arteria carótida izquierda del nervio vago distalmente para evitar la paresia ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3-0 sutura reabsorbible	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 sutura no absorbible	B. Braun, Alemania	G0762563
6-0 sutura no absorbible	B. Braun, Alemania	C0766070
9-0 sutura no absorbible	B. Braun, Alemania	G1111140
Adrenaline	Amino AG	1445419	any generic
Amiodarone	Helvepharm AG	5078567	cualquier genérico
Máquina de anestesia	Dräger		any other
Aspirin	Sanofi-Aventis (Suisse) SA	622693	any generic
Atropine	Labatec Pharma SA	6577083	any generic
Filtro de paso de banda azul	Thorlabs	FD1B	any other
Filtro de paso de banda verde	Thorlabs	FGV9	any other
Pinzas bipolares			any other
Bicycle spotlight			any other
Biemer vessel clip (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Suiza	FD560R	temporary
Índice bispectral (neonatal)			any other
Manguito de presión arterial (neonatal)			any other
Clamoxyl	GlaxoSmithKline AG	758808	any generic
Dexmedetomidina	Ever Pharma	136740-1	cualquier genérico
Electrodos de			any other
Elastase	Sigma Aldrich	45125	any generic
Ephedrine	Amino AG	1435734	cualquier genérico
Esmolol	OrPha Swiss GmbH	3284044	any generic
Fentanilo (uso intravenoso)	Janssen-Cilag AG	98683	any generic
Fentanilo (transdérmico)	Mepha Pharma AG	4008286	cualquier genérico
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fragmin	Pfizer PFE Switzerland GmbH	1906725	any generic
Glyco			any generic
Almohadilla térmica			any other
Solución isotónica de cloruro de sodio (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Ketamine	Pfizer	342261	any generic
Laboratory shaker	Stuart	SRT6	any other<
Streuli Pharma AG	747466	cualquier genérico
Longuettes			any other
Metacam	Boehringer Ingelheim	P7626406	cualquier genérico
Methadone	Streuli Pharma AG	1084546	cualquier genérico
Microtubos			any other
Micro needle holder			any other
Midazolam	Accord Healthcare AG	7752484	any generic
Needle holder			any other
O2-Face mask			any other
Operation microscope	Wild Heerbrugg		any other
Papaverine	Bichsel		any generic
Prilocaine-lidocaine crème	Emla		any generic
Propofol	B. Braun Medical AG, Switzerland		any generic
Oxímetro			any generic
Sonda de temperatura rectal (neonatal)			any other
Ropivacaine	Aspen Pharma Schweiz GmbH	1882249	any generic
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Afeitadora			cualquier otro
Smartphone			any other
Pinzas para tejidos blandos			any other
Esparcidor			any other
Tazones de			any other
Sorthop estériles			any other<
		any other
Micro-fórceps			any other
Straight-td micro-scissors	any other	Pinzas rectas
Surgery paño
		any other
tijeras quirúrgicas			any other
Jeringas 1 ml, 2ml y 5 ml			any other
Tris-Buffer	Sigma Aldrich	93302	any generic
Aplicador de clip vascular	B. Braun, Alemania	FT495T
Catéter de venas y arteriales 22 G			any generic
Vitarubin	Streuli Pharma AG	6847559	any generic
Yasargil titan standard clip (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Suiza	FT242T	temporal

electrocardiograma td style='height:15.75pt;'>Lidocaineother de pulso de animales pequeños de tejidos blandos esponja de acero inoxidable td style='height:15.75pt;'>Steastoscope rectas y curvas y curvas any other