Mediciones basadas en impedancia de la invasión de células cancerosas cerebrales

Resumen

Fuente: Mudduluru, G., et. al. Medición en tiempo real basada en impedancia de la migración e invasión de células cancerosas. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra un ensayo basado en impedancia para medir la invasión y migración de células de glioblastoma. Las células degradan la matriz extracelular, se mueven a través de membranas microporosas y se adhieren a los electrodos, generando impedancia. Este análisis en tiempo real refleja su potencial invasivo para aplicaciones de investigación del cáncer.

Protocolo

1. Preparación del sistema de análisis de células en tiempo real, placas de invasión y migración de células (CIM) y células U-118MG electroporadas para el recubrimiento

1. Coloque el sistema de análisis de celdas en tiempo real en un CO₂ incubadora en condiciones de cultivo 5–6 h antes del inicio del experimento para estabilizar el sistema a las condiciones de cultivo.
2. Para el ensayo de invasión, placa de 50 μL de DMEM (medio simple) que contiene gel de matriz extracelular (ECM) a 0,1 μg/μL en cada pocillo de la cámara superior de la placa CIM. Para evitar que queden burbujas de aire, utilice el método de pipeteo inverso. Retire inmediatamente 30 μL de gel ECM, dejando 20 μL en el pocillo.
3. Después del recubrimiento de gel ECM, mantenga la placa en la incubadora en condiciones de cultivo durante 4 h con la tapa puesta. Durante el recubrimiento y secado del gel ECM, tome medidas preventivas para evitar el contacto directo con los electrodos de la cámara superior de las placas con las manos, las superficies del gabinete de bioseguridad o el CO₂ incubadora.
4. Para configurar el programa de medición de impedancia, haga doble clic en el icono del software asociado (consulte Table of Materials) para abrir la aplicación de software del sistema (unidad de control). Cada cuna tiene una ventana individual con diferentes pestañas para establecer las condiciones experimentales, el intervalo de tiempo y la duración de la medición de impedancia y el análisis de datos.
5. Bajo el Layout pestaña, establezca pocillos cuadruplicados para cada condición biológica y establezca mediciones de impedancia celular de dos pasos bajo el Schedule pestaña. El primer paso es una medición de referencia de una sola vez (un barrido con un intervalo de 1 minuto), y el segundo paso es medir la impedancia de la celda en las cunas individuales respectivas para un experimento real. Para la migración, utilice 145 barridos con un intervalo de 10 minutos, y para la invasión, 577 barridos con un intervalo de 10 minutos, ajustados individualmente) en las cunas individuales respectivas.
6. Una hora antes del inicio de la medición de la impedancia de la celda, agregue 160 μL de DMEM con 10% de FBS como quimioatrayente a los pocillos de la cámara inferior de la placa. Ensamble la cámara superior que contiene los pocillos recubiertos de gel ECM o los pocillos sin recubrimiento con la cámara inferior para medir la invasión y la migración, respectivamente.
7. Llene los pocillos de la cámara superior con 50 μL de medio sérico bajo y colóquelos en la cuna del sistema. Compruebe si la unidad de control reconoce todos los pocillos haciendo clic en el Message pestaña. Si el mensaje se muestra como OK, la placa en la cuna está lista para el experimento.
8. Preincube las placas completamente empaquetadas en la incubadora en condiciones de cultivo durante 1 h antes de las mediciones en la base del sistema de análisis celular en tiempo real, que es esencial para la aclimatación de una placa empaquetada a las condiciones de cultivo celular.
9. Para la recolección de células tratadas con un medio de suero bajo, lavar las células que crecen en placas de cultivo con 1x PBS y añadir 2 mL de tripsina-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) al 0,05%). Colocar en la incubadora durante 30 s y retirar la tripsina-EDTA. Recoge celdas en el low serum medium en un tubo de 15 mL y cuenta las celdas utilizando un contador de celdas automatizado de mano.
10. Después de contar, centrifugar las celdas a 100 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
11. Resuspender 800.000 células en 800 μL de medio sérico bajo para los ensayos de migración e invasión. Además, resuspenda 300.000 células en 2 mL de medio de cultivo y siembra en una placa de 35 mm para el análisis de Western blot para confirmar la eliminación regulada de Crk y CrkL.

2. Lectura de línea base, siembra de las células y medición y visualización de la impedancia de las células

1. Mida la lectura de la línea de base haciendo clic en la cuna Start button. La línea de base debe leerse después de preincubar las placas durante 1 h en la cuna del sistema de análisis celular en tiempo real en condiciones de cultivo en la incubadora de dióxido de carbono y antes de sembrar las células en los pocillos respectivos en la cámara superior.
   NOTE: Una vez la cunaStart se hace clic en el botón, la unidad de control le preguntará si desea guardar el archivo experimental. Una vez guardado el archivo, el analizador de cuna mide la impedancia de la celda de referencia tal y como se estableció inicialmente en el programa y entra en un modo de pausa hasta que la cuna Start botón se vuelve a hacer clic para medir la impedancia de la celda en el segundo paso.
2. Saque ambas placas para la migración y la invasión de las cunas después de la medición de referencia y guárdelas en el gabinete de bioseguridad.
3. Siembre 100 μL de células (100.000 células) en cuadruplicados para cada condición biológica en la cámara superior de la placa CIM en los pocillos respectivos según lo programado en la unidad de control de la cuna mediante pipeteo inverso para evitar burbujas de aire.
4. Después de la siembra, mantenga la placa debajo de un gabinete de bioseguridad durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que las células se asienten uniformemente hasta el fondo. Transfiera la placa de nuevo a la base respectiva y haga clic en el botón de inicio de la base para comenzar a medir la impedancia de la celda según lo programado en el segundo paso de 1.5.
5. Después del último barrido, el experimento finaliza y los resultados se guardan automáticamente.
6. Bajo el Data Analysis pestaña, visualice los cambios en la impedancia de la celda como índice de celda de una manera dependiente del tiempo durante o después de la finalización del experimento. Cada una de las condiciones respectivas de los cuadruplicados se puede visualizar individualmente o como promedios y/o desviaciones estándar haciendo clic en el Options cuadros para promedio y desviación estándar.
7. Para exportar datos de índice de celda a un archivo de hoja de cálculo, abra un archivo de hoja de cálculo vacío, coloque el cursor en el centro de la Data Analysis ventana y haga clic con el botón derecho. En el cuadro de diálogo que aparece, elija la opción Copy Data into List Format y pegue los datos en la hoja de cálculo abierta.
8. Ajuste el tiempo en los datos sin procesar para representar el tiempo de inicio real de la medición de impedancia de celda. La hora de inicio del segundo paso se establece en cero.
   NOTE: La unidad de control tiene la opción de obtener el índice de celda con o sin normalización (es decir, índice de celda normalizado) y visualizar los resultados como una presentación gráfica de manera dependiente del tiempo. En este ejemplo, los datos de índice de celda se exportan sin normalización para su procesamiento y presentación gráfica.
9. Libere el experimento haciendo clic en el botón Release botón en cada cuna.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
CIM plates	División de Análisis Celular de Agilent Technologies, Inc	5665825001	Placas de invasión y migración
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	302002	Medio de cultivo utilizado para la célula
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS used to wash the cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Incubadora de dióxido de carbono Heracell VIOS 160i	ThermoFisher Scientific	51030285	Incubadora
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix gel
RTCA software	División de Análisis Celular de Agilent Technologies, Inc		Instrumento utilizado para el experimento
Scepter	Millipore	C85360	Contador
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Líneas celulares utilizadas para experimentos
xCELLigence RTCA DP	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	380601050

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