Desarrollo de un modelo de presión translaminar utilizando un sistema autónomo translaminar

Abstract

Fuente: Sharma, T. P., et al., Modelo de sistema autónomo translaminar para la modulación de la presión intraocular e intracraneal en segmentos posteriores de donantes humanos. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra el procedimiento de preparación de un ojo humano para estudiar los efectos de la presión translaminar en la señalización de las células ganglionares de la retina mediante la simulación de presiones intraoculares e intracraneales en un sistema autónomo translaminar.

Protocol

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las pautas del IRB del instituto.

1. Preparación y esterilización de equipos y suministros

1. Consulte la Tabla de Materiales para obtener una lista completa de los suministros necesarios, así como los números de proveedor y catálogo.
2. Antes de usar, esterilice todo el equipo e instrumentos mediante autoclave o utilizando ampollas de óxido de etileno.

2. Preparación del medio de perfusión

1. Añadir 1% de penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL de penicilina, 10.000 μg/mL de estreptomicina en NaCl al 0,85%) y L-glutamina al 1% (200 mM) a 1.000 mL de medio de Águila modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa.
2. Esterilizar el medio de perfusión pasando a través de un filtro de 0,22 μm.

3. Configuración del sistema autónomo translaminar (TAS)

1. Configurar jeringas de entrada (depósitos de presión intraocular (PIO) y presión intracraneal (PIC)).
   1. Añadir 30 mL del medio de perfusión (sección 2) a una jeringa de 30 mL. Conecte una llave de paso de 3 vías a la jeringa de 30 ml. Coloque un filtro hidrófilo de 0,22 μm en la llave de paso de 3 vías. Conecte un adaptador de muñón Luer de 15 G al filtro hidrófilo de 0,22 μm.
   2. Retire las burbujas de aire de la configuración de la jeringa. Conecte el tubo al adaptador de tubo Luer de 15 G. Cierre el puerto lateral de la llave de paso con una tapa de bloqueo universal sin ventilación. Repita para un total de dos configuraciones.
   3. Etiquete una jeringa como presión intracraneal del canal 1 (CH1 ICP) y la otra jeringa como presión intraocular del canal 2 (CH2 IOP).
2. Instale jeringas de salida (reservorios IOP e ICP).
   1. Conecte una llave de paso de 3 vías a una jeringa de 30 ml. Conecte un adaptador de muñón Luer de 15 G a la llave de paso de 3 vías. Conecte el tubo al adaptador de tubo Luer de 15 G.
   2. Cierre el puerto lateral de la llave de paso con una tapa de bloqueo universal sin ventilación. Repita para un total de dos configuraciones. Etiquete una jeringa como CH1 ICP y la otra jeringa como CH2 IOP.

4. Preparación del globo ocular humano completo

NOTA: Si se reciben ojos completos, siga el procedimiento a continuación para separar el segmento anterior del segmento posterior del ojo. Si los ojos se reciben divididos en dos, comience en el paso 4.4.

1. Coloque un ojo entero en la solución de povidona yodada durante 2 min.
2. Enjuague el ojo con una solución estéril tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la povidona yodada. Repita dos veces.
3. Retire los anexos de todo el globo ocular con pinzas y tijeras. Disecciona el ojo en el ecuador para separar los segmentos anterior y posterior del ojo.
4. Retire la vaina del nervio óptico. Eliminar el humor vítreo del segmento posterior.
5. Recorte la esclerótica adicional del segmento posterior, si es necesario, para asegurar un buen ajuste en la cúpula redonda de la cámara de PIO (inferior). Con unas pinzas, asegúrese de que la retina se extienda uniformemente sobre la parte posterior del segmento.
6. Configuración de la cámara de PIO (inferior)
   1. Coloque el segmento posterior humano en la cámara de PIO (inferior) del TAS sobre la cúpula redonda con el nervio óptico hacia la parte superior.
   2. Selle el segmento posterior con la junta tórica de resina epoxi con cuatro tornillos, asegurando un sellado hermético.
   3. Inserte el tubo en los puertos IN y OUT de la cámara IOP (inferior). La jeringa de entrada de PIO con tubo que contiene medio se inserta en el puerto de entrada y la jeringa de salida de PIO vacía con tubo se inserta en el puerto de salida.
   4. Utilice el método de empuje/tracción para infundir lentamente el medio de perfusión en el puerto de entrada para llenar la copa del ojo posterior y, al mismo tiempo, extraer lentamente el medio de perfusión a través de la jeringa de salida para eliminar las burbujas de aire de las vías. Deje de infundir el medio una vez que los tubos de entrada y salida estén libres de burbujas de aire.
   5. Bloquee las llaves de paso en la posición de apagado. Retire la jeringa de 30 ml del conjunto del filtro del puerto IOP IN y vuelva a llenarla con 30 ml de medio. Luego, reemplace la jeringa con el conjunto del filtro.
7. Configuración de la cámara ICP (superior)
   1. Coloque la cámara/tapa ICP (superior) sobre la parte posterior del segmento posterior. Asegúrese de que el nervio óptico esté dentro de la cámara superior. Selle la cámara superior con cuatro tornillos.
   2. Inserte el tubo en los puertos IN y OUT de la cámara ICP (superior). La jeringa de entrada ICP con tubo que contiene medio se inserta en el puerto IN y la jeringa de salida ICP vacía con tubo se inserta en el puerto OUT.
   3. Infunda suave y lentamente el medio en el puerto IN para llenar la cámara ICP y eliminar las burbujas de aire de las líneas utilizando el método de empujar / tirar. Deje de infundir el medio una vez que la cámara ICP y los tubos de entrada y salida estén libres de burbujas de aire.
   4. Bloquee las llaves de paso en la posición de apagado. Retire la jeringa de 30 ml del conjunto del filtro ICP en el puerto y vuelva a llenarla con 30 ml de medio. Luego, reemplace la jeringa con el conjunto del filtro.

Materials