Desarrollo de un modelo de presión translaminar utilizando un sistema autónomo translaminar

Resumen

Fuente: Sharma, T. P., et al., Modelo de sistema autónomo translaminar para la modulación de la presión intraocular e intracraneal en segmentos posteriores de donantes humanos. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra el procedimiento de preparación de un ojo humano para estudiar los efectos de la presión translaminar en la señalización de las células ganglionares de la retina mediante la simulación de presiones intraoculares e intracraneales en un sistema autónomo translaminar.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las pautas del IRB del instituto.

1. Preparación y esterilización de equipos y suministros

1. Consulte la Tabla de Materiales para obtener una lista completa de los suministros necesarios, así como los números de proveedor y catálogo.
2. Antes de usar, esterilice todo el equipo e instrumentos mediante autoclave o utilizando ampollas de óxido de etileno.

2. Preparación del medio de perfusión

1. Añadir 1% de penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL de penicilina, 10.000 μg/mL de estreptomicina en NaCl al 0,85%) y L-glutamina al 1% (200 mM) a 1.000 mL de medio de Águila modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa.
2. Esterilizar el medio de perfusión pasando a través de un filtro de 0,22 μm.

3. Configuración del sistema autónomo translaminar (TAS)

1. Configurar jeringas de entrada (depósitos de presión intraocular (PIO) y presión intracraneal (PIC)).
   1. Añadir 30 mL del medio de perfusión (sección 2) a una jeringa de 30 mL. Conecte una llave de paso de 3 vías a la jeringa de 30 ml. Coloque un filtro hidrófilo de 0,22 μm en la llave de paso de 3 vías. Conecte un adaptador de muñón Luer de 15 G al filtro hidrófilo de 0,22 μm.
   2. Retire las burbujas de aire de la configuración de la jeringa. Conecte el tubo al adaptador de tubo Luer de 15 G. Cierre el puerto lateral de la llave de paso con una tapa de bloqueo universal sin ventilación. Repita para un total de dos configuraciones.
   3. Etiquete una jeringa como presión intracraneal del canal 1 (CH1 ICP) y la otra jeringa como presión intraocular del canal 2 (CH2 IOP).
2. Instale jeringas de salida (reservorios IOP e ICP).
   1. Conecte una llave de paso de 3 vías a una jeringa de 30 ml. Conecte un adaptador de muñón Luer de 15 G a la llave de paso de 3 vías. Conecte el tubo al adaptador de tubo Luer de 15 G.
   2. Cierre el puerto lateral de la llave de paso con una tapa de bloqueo universal sin ventilación. Repita para un total de dos configuraciones. Etiquete una jeringa como CH1 ICP y la otra jeringa como CH2 IOP.

4. Preparación del globo ocular humano completo

NOTA: Si se reciben ojos completos, siga el procedimiento a continuación para separar el segmento anterior del segmento posterior del ojo. Si los ojos se reciben divididos en dos, comience en el paso 4.4.

1. Coloque un ojo entero en la solución de povidona yodada durante 2 min.
2. Enjuague el ojo con una solución estéril tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la povidona yodada. Repita dos veces.
3. Retire los anexos de todo el globo ocular con pinzas y tijeras. Disecciona el ojo en el ecuador para separar los segmentos anterior y posterior del ojo.
4. Retire la vaina del nervio óptico. Eliminar el humor vítreo del segmento posterior.
5. Recorte la esclerótica adicional del segmento posterior, si es necesario, para asegurar un buen ajuste en la cúpula redonda de la cámara de PIO (inferior). Con unas pinzas, asegúrese de que la retina se extienda uniformemente sobre la parte posterior del segmento.
6. Configuración de la cámara de PIO (inferior)
   1. Coloque el segmento posterior humano en la cámara de PIO (inferior) del TAS sobre la cúpula redonda con el nervio óptico hacia la parte superior.
   2. Selle el segmento posterior con la junta tórica de resina epoxi con cuatro tornillos, asegurando un sellado hermético.
   3. Inserte el tubo en los puertos IN y OUT de la cámara IOP (inferior). La jeringa de entrada de PIO con tubo que contiene medio se inserta en el puerto de entrada y la jeringa de salida de PIO vacía con tubo se inserta en el puerto de salida.
   4. Utilice el método de empuje/tracción para infundir lentamente el medio de perfusión en el puerto de entrada para llenar la copa del ojo posterior y, al mismo tiempo, extraer lentamente el medio de perfusión a través de la jeringa de salida para eliminar las burbujas de aire de las vías. Deje de infundir el medio una vez que los tubos de entrada y salida estén libres de burbujas de aire.
   5. Bloquee las llaves de paso en la posición de apagado. Retire la jeringa de 30 ml del conjunto del filtro del puerto IOP IN y vuelva a llenarla con 30 ml de medio. Luego, reemplace la jeringa con el conjunto del filtro.
7. Configuración de la cámara ICP (superior)
   1. Coloque la cámara/tapa ICP (superior) sobre la parte posterior del segmento posterior. Asegúrese de que el nervio óptico esté dentro de la cámara superior. Selle la cámara superior con cuatro tornillos.
   2. Inserte el tubo en los puertos IN y OUT de la cámara ICP (superior). La jeringa de entrada ICP con tubo que contiene medio se inserta en el puerto IN y la jeringa de salida ICP vacía con tubo se inserta en el puerto OUT.
   3. Infunda suave y lentamente el medio en el puerto IN para llenar la cámara ICP y eliminar las burbujas de aire de las líneas utilizando el método de empujar / tirar. Deje de infundir el medio una vez que la cámara ICP y los tubos de entrada y salida estén libres de burbujas de aire.
   4. Bloquee las llaves de paso en la posición de apagado. Retire la jeringa de 30 ml del conjunto del filtro ICP en el puerto y vuelva a llenarla con 30 ml de medio. Luego, reemplace la jeringa con el conjunto del filtro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack	Amazon<
114 Junta tórica Buna-N, durómetro de 70A, negro, 5/8" de diámetro interior, 13/16" de diámetro exterior, 3/32" de ancho (paquete de 100)	Amazon	B000FMYRHK
30 mL Jeringas sin Aguja	Vitality Medical	302832
Llave de paso de 3 vías, 2 cerraduras Luer hembra, cerradura Luer macho giratoria, tapa ventilada	QOSINA	2C6201
4-40 x 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & tamaño apropiado destornillador Phillips	Brikksen Stainless Steel Fastners	PPMSSSCH4C.5
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE	Fisher Scientific	NC9085343
Betadine	Purdue	PUR1815001EACH
Corning 100 x 20mm platos de cultivo	Sigma-Aldrich	CLS430167-100EA
Corning L-glutamine Solution	Fisher Scientific	MT25005CI
Covidien 3033 Esponja de gasa de curidad, 4" x 4", 12 capas, estéril, 1200/CS	Med Plus Medical Supply	COV-3033-CS
Pinza de vendaje delicada curvada (dentada)	Katena	K5-4010
Dumont #5 - Pinzas finas	F.S.T.	11254-20
Eye Scissors Standard Curved	Katena	K4-7410
Falcon 150 x 15mm Placas de Petri Desechables Estériles Lisas	Capitol Scientific	351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers	Fisher Scientific	16-320-730
Fisherbrand Instant Sealling Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-54
Fisherbrand Instant Sealling Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-58
HyClone Águilas modificadas de Dulbecco Medium	Fisher Scientific	SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution	Fisher Scientific	SV30010
Filtro Hidrofílico con Entrada Luer Lock Hembra, Salida de Deslizamiento Luer Macho, Azul y Transparente	Qosina	28217
Transductores de presión hidrostática, DELTRAN ® II, Catálogo # DPT-200 con un caudal de 3CC/HR	AD instruments	DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box	Jenson Global	JG15-0.5HPX 15 style='width:174pt;'>
Keyence B2‐X710 microscope	Keyence	B2-X710
LabChart 8	AD instruments	LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer	Leica	ST5020
Tapa Luer Universal No Ventilada, Blanca	QOSINA	65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228)	AD instruments	FE228
Pharmco Products ALCOHOL ETÍLICO, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398
Solución tamponada de fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)	AD instruments	PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Macho	McMAster-Carr	7880T113
Racor de Tubo Push-to-Connect con Rosca Universal para Aire y Agua, Adaptador, Tubo de 1/8" OD x 1/8 Tubo	McMAster-Carr
width:174pt;'Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Tubo Flexible 500 ft.	Fisher Scientific	14-171-268
Superblock T20	Fisher Scientific	PI37536
Tijeras quirúrgicas - Sharp-Blunt	F.S.T.	14001-14
Pinzas de Tejido Delicado 1x2 Dientes Curvos	Katena	K5-4110
Sistema Autónomo Translaminar (TAS)	Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad del Norte de Texas	N/A
USA Tamaño 030 junta tórica Buna-N, B1000, 70 Durómetro, Negro, Buna-N (NBR, Nitrilo, Buna)	Marco Rubber & Plastics	B1000-030

td style='width:174pt;'>B07DRGPPZJ