Ensayo de fagocitosis de células vivas de células similares a la microglía utilizando sinaptosomas humanos

Resumen

Fuente: Funes, S., et. al., Células similares a la microglía humana: diferenciación de células madre pluripotentes inducidas y ensayo de fagocitosis de células vivas in vitro utilizando sinaptosomas humanos. J. Vis. Exp. (2022)

Este video muestra un ensayo para estudiar la capacidad fagocítica de células similares a la microglía utilizando sinaptosomas marcados con colorantes fluorescentes sensibles al pH.

Protocolo

1. Ensayo de fagocitosis de células vivas
   1. Plate 20-30 ×^{10 4} PMPs en placas de 96 pocillos en 100 μL de medio completo iMG y siga el proceso de diferenciación durante 10 días.
   2. El día del ensayo, prepare la solución de tinción nuclear añadiendo 1 gota de una tinción nuclear para células vivas en 2 mL de medio basal iMG.
   3. Retire 40 μL de medio por pocillo de la placa de 96 pocillos y agregue 10 μL de la solución de tinción nuclear utilizando una pipeta multicanal. Incubar la placa a 37 °C y 5% de CO₂ durante 2 h.
   4. Descongele los sinaptosomas marcados en hielo y sonique suavemente usando un sonicador de agua durante 1 min. Transfiera inmediatamente los sinaptosomas de nuevo al hielo. Diluir los sinaptosomas marcados en medio completo iMG en una proporción de 1 μL de sinaptosomas por 50 μL de medio.
      NOTA: La concentración de sinaptosomas depende del ensayo y puede requerir optimización. Para mantener un porcentaje relativamente bajo (es decir, 0,1% o menos) de DMSO en el medio, se recomienda no añadir más de 2 μL de sinaptosomas por pocillo.
   5. Como control negativo, pretrate algunos pocillos con citocalasina D para inhibir la polimerización de actina y, por lo tanto, la fagocitosis. Prepare una solución de 60 μM de citocalasina D en medio completo iMG. Añadir 10 μL de esta solución a cada pocillo para obtener una concentración final de 10 μM e incubar a 37 °C y 5% de CO₂ durante 30 min.
   6. Retire la placa de la incubadora e incube a 10 °C durante 10 min. Mantenga la placa en hielo y agregue 50 μL de medio que contenga sinaptosomas.
   7. Centrifugar la placa a 270 × g durante 3 min a 10 °C y mantener la placa en hielo hasta la adquisición de la imagen.
Adquisición y análisis de imágenes
Inserte la placa en un lector de imágenes de células vivas y seleccione los pocillos a analizar.
3. Seleccione una lente de objetivo de 20x.
4. Ajusta el enfoque, la intensidad del diodo emisor de luz (LED), el tiempo de integración y la ganancia de los canales de campo claro y azul (4',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]). La fluorescencia de los sinaptosomas debe ser insignificante en el punto de tiempo inicial. Utilice el canal de campo claro como referencia para centrarse en el canal rojo (RFP). El tiempo de integración y la ganancia pueden variar entre experimentos; use estos ajustes iniciales para el canal rojo: LED: 4, tiempo de integración: 250 y ganancia: 5.
5. Seleccione el número de mosaicos individuales que se adquirirán en un montaje por pozo (por ejemplo, adquiera 16 mosaicos en el centro del pozo, obteniendo así aproximadamente el 5% del área total del pozo). Ajuste la temperatura a 37 °C y el intervalo de tiempo deseado para la obtención de imágenes.
   NOTA: Las imágenes se adquirieron cada 1 - 2 h durante un máximo de 16 h en este estudio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cell culture materials
Primary 96-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning<
CellAdhere Laminin-521	STEMCELL Tecnología	77004	Referido a laminin 521
Components of iMG base media<
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010	Final concentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentración final 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	Concentración final 1x
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Concentración final 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Concentración final 55 μM
IL-34	PeproTech or Biologend	200-34 or 577904	Concentración final 100 ng/mL
iMG base media<		Concentración final 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	Concentración final 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	Concentración final 50 ng/mL
Colorantes de ensayo de fagocitosis	<
NucBlue Live Ready reagent	Invitrogen	R37605
pHrodo Red, éster sucintomidílico	ThermoFisher Scientific	P36600	Referido como a tinte
Other cell-culture reagents
Cytochalasin D	Sigma		Concentración final 10 μM
Software and Equipment<
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 lector de imágenes de células vivas	Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	Biotek	version 3.03

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