Detección del cotransportador neuronal de cloruro de potasio fosforilado 2 mediante Western Blotting

Resumen

Fuente: Josiah, S. S., et al. Estudio de las funciones y actividades del cotransportador neuronal de K-Cl KCC2 mediante Western blot. J. Vis. exp. (2022).

El video muestra los pasos para detectar y cuantificar la proteína cotransportadora 2 de cloruro de potasio fosforilado (KCC2) en un lisado celular. Este proceso implica inmunoprecipitación para aislar KCC2 fosforilada y quimioluminiscencia para cuantificar la proteína aislada.

Protocolo

1. Cell culture and transfection

1. Calentar todos los reactivos en el baño de perlas (37 °C) antes del procedimiento de cultivo celular. Prepare el medio de cultivo, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado con 10% de suero fetal bovino, 1% de 2 mM de L-glutamina, 100 mM de aminoácidos no esenciales, 100 mM de piruvato de sodio y 100 unidades/mL de penicilina-estreptomicina.
2. Descongele 293 células de riñón embrionario humano de rata KCC2b transfectado de manera estable (HEK293^rnKCC2b) completamente en el baño de perlas (37 °C). Transfiera las células del tubo criovial a un tubo de centrífuga que contenga 5 mL de medio fresco. Gira la celda a 1200 ×g durante 3-5 min.
3. Utilice una pipeta aspiradora (fijada a una bomba de vacío) para aspirar el sobrenadante y añada 10 mL de medio fresco para volver a suspender las células. Transfiera la suspensión de la celda a una placa de plato de 10 cm.
4. Coloque la placa en la incubadora y déjela crecer durante 48 h a 37 °С en una atmósfera humidificada con 5% de CO₂. Controle el período de incubación para garantizar un crecimiento celular saludable. Divida aún más las células cuando hayan alcanzado más del 90% de confluencia después del período de incubación.
5. Aspire el medio viejo fuera del plato de células y enjuague suavemente las células con 2 mL de solución salina tampón de fosfato (PBS). Añadir 2 mL de tripsina e incubar durante unos 1-2 min a temperatura ambiente.
6. Use 2 mL de medio completo para lavar suavemente las células tripsinizadas en el plato. Agregue 9 mL de medio fresco a los platos nuevos y agregue 1 mL de solución del plato viejo a cada uno de los nuevos. Transfiera las placas de celda dividida a la incubadora durante 48 h para lograr ≥ confluencia del 90%.
7. Trate las células con dimetilsulfóxido (DMSO) como control, 8 μM de estaurosporina o 0.5 mM de N-etilmaleimida (NEM) durante 15 min antes de recolectar las células en tampón de lisis.

2. Preparación de lisados celulares y carga de muestras

1. Aspirar los medios en la placa de cultivo (de los procedimientos de transfección). Coloque el cultivo celular en hielo y lave las células con PBS helado.
2. Aspire el PBS, luego agregue 1.0 mL de tampón de lisis helado que contenga 50 mM de tris-HCl (pH 7.5), 1 mM de etilenglicol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA), 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 50 mM de fluoruro de sodio, 5 mM de pirofosfato de sodio, 10 mM de sodio-β-glicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sodio, 1% (p/v) Triton X-100, 0,27 M de sacarosa, 1 mM de benzamina, 0,1% (v/v) de 2-mercaptoetanol y 2 mM de fenilmetilsulfonilo de fluoruro (PMSF) a la placa.
   NOTA: El volumen de tampón de lisis durante la recolección de células varía con el tamaño de los platos, por ejemplo, 1 mL de tampón de lisis es adecuado por 1 x 10⁷ celdas/plato de 100 mm/matraz de 150 cm², mientras que 0,5 mL es adecuado por matraz de 5 x 10⁶ celdas/plato de 60 mm/matraz de 75 cm².
3. Use un raspador de células de plástico frío para raspar las células del fondo del plato, luego use suavemente una pipeta para transferir la suspensión de células a un tubo de microcentrífuga que ya está en hielo. Agite constantemente el tubo durante 30 minutos a 4 °C.
4. Haga girar los lisados celulares en una centrífuga fría (4 °C) a 16,000 x g durante 20 min, retire el tubo suavemente de la centrífuga y colóquelo en hielo. Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo preenfriado y deseche el pellet.
   NOTA: Puede ser necesario variar la fuerza y el tiempo de centrifugación dependiendo del tipo de celda. Sin embargo, las pautas generales recomiendan la centrifugación a 16.000 x g durante 20 minutos. Sin embargo, esto debe determinarse para cada experimento. Por ejemplo, las células delicadas como los leucocitos necesitan una velocidad de centrifugación muy ligera.

3. Preparación de inmunoprecipitantes a partir de lisados celulares

1. Pipetea 300 μL de proteína-G-sefarosa en un tubo de microcentrífuga. Centrifugar la solución a 500 x g durante 2 min y desechar el sobrenadante.
2. Añade 500 μL de PBS y vórtice bien la solución. Centrifugar la solución a 500 x g durante 2 min y desechar el sobrenadante. Repita este paso.
3. Mezcle 1 mg de anticuerpos anti-KCC2 Thr906 y anti-KCC2 Thr1007 con 200 μL de perlas de proteína G-sepharose y compense el volumen hasta 500 μL con PBS. Agitar en una plataforma vibratoria o rueda giratoria durante 2 h a 4 °C. Lavar 2 veces con PBS.
4. Realiza la cuantificación de proteínas en los lisados de células enteras y añade 1 mg del lisado celular a las perlas lavadas. Incubar suavemente en un rotador de extremo a extremo durante 2 h a 4 °C. Girar las perlas y lavarlas 3 veces con PBS que contenga 150 mM de cloruro de sodio (NaCl).
5. Lavar inmunoprecipitantes (perlas) 3x con 200 μL de PBS. Vuelva a suspender el pellet final en 100 μL de 1x tampón de muestra de dodecil sulfato de litio (LDS).
6. Agite los tubos en un agitador de rotor a temperatura ambiente durante 5 min e incube en un bloque calefactor a 75 °C durante 10 min. Centrifugar la muestra de carga a 11,000 x g durante 2 min y use el sobrenadante para la carga de gel.

4. Realizando el western blot

1. Ensamble el aparato de fundición y vierta un gel separador al 8% recién preparado (consulte la Tabla 1 para la receta / preparación) para fundir el gel, dejando aproximadamente 2 cm de espacio desde la parte superior del vidrio de fundición. Agregue 200 μL de isopropanol absoluto a la configuración y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos.
   NOTA: La receta de gel de poliacrilamida para la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) depende del tamaño de la proteína de interés (Tabla 2). Por lo tanto, tome nota del tamaño de la proteína antes de determinar el porcentaje de gel deseado.
2. Use una pipeta para eliminar el isopropanol y enjuague cuidadosamente el gel con aproximadamente 200 μL de agua destilada. Agregue gel apilante al 6% recién preparado (consulte la Tabla 1 para la receta / preparación) para llenar el espacio de aproximadamente 2 cm en la configuración de lanzamiento. Coloque suavemente en el peine del pocillo y deje reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
3. Fija el gel fundido en el tanque de electroforesis.
4. Disuelva 30.3 g de Tris base, 144.1 g de glicina y 10 g de SDS en 1000 mL de agua destilada para preparar 10x tampón de transferencia. Prepare 1x tampón de funcionamiento agregando 10 mL de SDS al 10% y 100 mL de tampón de transferencia 10x a 890 mL de agua destilada.
5. Vierte 1x tampón de funcionamiento en el tanque. Cargue 5 μL de marcador de peso molecular en el primer pocillo y una cantidad igual de proteína en cada pocillo del gel SDS-PAGE (entre 18-30 μL, dependiendo del tamaño del panal utilizado). Llene los pocillos vacíos con 1x LDS y haga funcionar el gel durante unos 90-120 minutos a 120 V.
6. Disuelve 58.2 g de base Tris y 29.3 g de glicina en 1000 mL de agua destilada para preparar 10x tampón de transferencia. Active la membrana de nitrocelulosa con 1x tampón de transferencia que contiene un 20% de metanol. Enjuague el gel y la membrana con el tampón de transferencia y extiéndalos suavemente en la pila de preparación.
   NOTA: No es necesario ajustar el pH de los tampones de funcionamiento y transferencia, ya que deben estar al pH óptimo requerido. Además, es recomendable preparar estos tampones y almacenarlos a temperatura ambiente antes del experimento para ahorrar tiempo.
7. Organice el sándwich a transferir en este orden: electrodo negativo (marco/extremo negro) - espuma sándwich - papel de filtro - gel SDS-PAGE enjuagado - membrana de nitrocelulosa enjuagada - papel de filtro - espuma sándwich - electrodo positivo (marco rojo). Apile el sándwich ensamblado en el tanque de transferencia y hágalo funcionar a 90 V durante 90 min o 30 V durante 360 min.

5. Tinción de anticuerpos y desarrollo de imágenes

1. Retira la membrana y déjala secar. Bloquee la membrana durante 1 h a temperatura ambiente utilizando un tampón de bloqueo hecho con un 5% de leche desnatada en solución salina tamponada Tris que contenga 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. Incubar las membranas con diluciones apropiadas de anticuerpo primario^8,15,19 y beta-actina (control de carga) en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C. Lave la membrana en tres lavados de 1x TBS-T durante 5 min cada uno.
   NOTA: La incubación de la membrana separada con controles de carga como los anticuerpos beta-actina, alfa-tubulina o gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa es para normalizar los otros resultados de Western blot durante la cuantificación posterior. La dilución recomendada para cada anticuerpo primario está disponible en el manual del fabricante.
3. Incubar la membrana lavada con anticuerpo secundario diluido 5000 veces en tampón de bloqueo durante 60 min a temperatura ambiente. Nuevamente, lave la membrana 3 veces en 1x TBS-T durante 5 minutos cada una.
   NOTA: Se recomienda encarecidamente que el anticuerpo secundario se eleve contra la especie en la que se genera el anticuerpo primario. Por ejemplo, si el anticuerpo primario del total de KCC2 es anti-KCC2 de ratón, se debe utilizar el anticuerpo secundario anti-ratón.
4. Coloque la membrana lavada en la placa de imagen. Mezcle volúmenes iguales de cada reactivo de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y extienda suavemente la solución mezclada sobre la membrana para desarrollar señales.

6. Adquisición de imágenes utilizando un sistema de imágenes y cuantificación de datos

1. Transfiera la tarjeta de imágenes al compartimento apropiado en el sistema de imágenes para la toma de imágenes. Abra el software de imágenes en la computadora para el procesamiento de imágenes.
2. En la barra de herramientas, haga clic en Nuevo protocolo y elija Canal único. Haga clic en Seleccionar en el cuadro de diálogo de imágenes/aplicación de gel, desplácese hasta Borrar y seleccione Chemi Hi Sensitivity o Chemi Hi Resolution. A continuación, haga clic en Configuración de acumulación de señal para establecer la duración y el número de imágenes a adquirir.
3. Haga clic en Colocar Gel en la configuración del protocolo y ajuste el gel en el sistema de imágenes si es necesario. Haga clic en Ejecutar protocolo para adquirir las imágenes.
4. Haga clic derecho en una de las imágenes adquiridas en el cuadro de catálogo de imágenes para guardar las imágenes en la computadora. Navegue hasta la imagen deseada y haga clic en Seleccionar imagen y continuar en el cuadro de diálogo de ejecución.
5. Haga clic en el icono de Transformación de Imagen para ajustar el contraste y la saturación de píxeles de la imagen. Haga clic en el icono Captura de pantalla en la barra de herramientas general para guardar la imagen en la computadora según el formato de imagen deseado.
6. Mida las densidades de banda utilizando el software ImageJ y analice utilizando las herramientas estadísticas adecuadas.

Resultados

Tabla 1: Receta para hacer una mezcla de gel de poliacrilamida (separar y apilar soluciones de gel).

8 mL de gel separador al 8%

Materiales