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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Cuantificación de somas de células ganglionares de la retina
NOTA: El siguiente procedimiento es para la cuantificación de somas RGC, basado en la tinción inmunohistoquímica de los flat-mounts de la retina con un anticuerpo contra la proteína 3A (Brn3a) del dominio homeobox/POU específica del cerebro.
- Transfiera las retinas aisladas a una placa de cultivo de 24 pocillos (una retina por pocillo) que contenga 1 mL de 1x PBS y mantenga la retina interna hacia arriba.
- Permeabilice el tejido lavando 3 veces durante 10 minutos con un tensioactivo no iónico al 0,5 % diluido en 1 PBS (0,3 ml). A continuación, mantenga el tejido agitando suavemente en albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en surfactante no iónico al 2% y 1x PBS (solución bloqueante; 0,25 mL) durante 60 min a temperatura ambiente.
- Durante el paso 1.2, prepare la solución de anticuerpo primario Brn3a diluyendo 1:200 en surfactante no iónico al 0,5% y 1x PBS más 5% de BSA, y guárdela a 4 °C.
- Después de 60 min de bloqueo tisular, incubar las retinas en 0,2 mL de solución de anticuerpo primario a 4 °C durante 72 h con una agitación suave.
- Lave el tejido 3 veces durante 10 minutos con 1x PBS, luego incube el tejido durante 2 h a temperatura ambiente en 0,2 mL de la solución de anticuerpos secundarios diluida 1:750 en 1x PBS más 5% BSA.
- Además, incube el tejido durante 10 minutos en una solución de contratinción nuclear para la tinción de núcleos fluorescentes. Concluya la inmunohistoquímica con un paso de lavado final con 1x PBS (0,3 mL) repetido 3 veces.
- Transfiera las retinas con la ayuda de dos pequeños cepillos a portaobjetos de microscopio de vidrio, manteniendo el lado vítreo hacia arriba. Coloque el cuadrante dorsal de la retina hacia arriba en los portaobjetos del microscopio. Realiza dos cortes radiales más hacia la cabeza del nervio óptico para delimitar los otros 3 cuadrantes (nasal, ventral y temporal).
NOTA: Las dimensiones de corte no son fijas. No deben ser demasiado cortas que perjudiquen un aplanamiento eficiente de la retina en el portaobjetos y no deben ser demasiado largas para que llegue al agujero del nervio óptico y separe completamente el cuadrante retiniano delimitado del resto del tejido. - Por último, aplique 0,2 ml de medio de montaje antidecoloración en un cubreobjetos de vidrio y colóquelo en la retina plana para el análisis microscópico de tejidos. Para estimar la densidad de RGCs, examine las monturas planas bajo un microscopio de epifluorescencia confocal utilizando un objetivo de 40x/1.3.
- Para cada cuadrante de la retina, tome ocho fotos: dos de la retina central (~0,9 mm del disco óptico), tres de la retina media (~2,0 mm del disco óptico) y tres de la retina periférica (~3,7 mm del disco óptico), lo que hace un total de 32 fotos por retina. Utilice el software FIJI para contar las células Brn3a positivas y estimar la densidad media de células.