Estimulación del sistema nervioso intracardíaco para evaluar la susceptibilidad a la arritmia

Resumen

Fuente: Jungen, C., et al. Impacto de las neuronas intracardíacas en la electrofisiología cardíaca y la arritmogénesis en un sistema Langendorff Ex vivo. J. Vis. Exp. (2018).

El video muestra una técnica ex vivo para estimular el sistema nervioso intracardíaco para evaluar la susceptibilidad del corazón a la arritmia. Usando un aparato de perfusión, un corazón de ratón aislado se perfunde con un tampón oxigenado. A continuación, se estimula el sistema nervioso intracardíaco a alta frecuencia para inducir arritmias.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Preparación del aparato de Langendorff

NOTA: Se utiliza un sistema de perfusión de Langendorff disponible en el mercado.

1. Prepare una solución de Krebs-Henseleit modificada (119 mM de cloruro de sodio, 25 mM de bicarbonato de sodio, 4,6 mM de cloruro de potasio, 1,2 mM de fosfato de potasio monobásico, 1,1 mM de sulfato de magnesio, 2,5 mM de cloruro de calcio, 8,3 mM de glucosa y 2 mM de piruvato de sodio). Para evitar la precipitación de calcio, agregue una mezcla de 95% de oxígeno/5% de dióxido de carbono a la solución de perfusión. Filtre el tampón con un tamaño de poro de 0,22 μm.
2. Añada un agente farmacológico al tampón para investigar su efecto sobre la electrofisiología cardíaca y la arritmogénesis según sea necesario.
3. Inicie el baño de agua y coloque en ella la solución de perfusión que incluye una mezcla de 95% de oxígeno/5% de dióxido de carbono. Ajuste la temperatura del baño de agua, de modo que la temperatura de la solución de perfusión directamente antes de la cánula sea de ~37 °C.
4. Tan pronto como se alcance la temperatura correcta, encienda la bomba de rodillos y llene el aparato con la solución de perfusión.
5. Ajuste la frecuencia de la bomba antes de conectar el corazón, de modo que no queden burbujas de aire en la cánula al montarla en el aparato.

2. Preparación de hardware y software

1. Conecte un sistema de adquisición de datos digitales y su software correspondiente al aparato Langendorff para un registro continuo de la presión de perfusión, el caudal y la frecuencia cardíaca.
   1. Ajuste la presión de perfusión objetivo en los ajustes generales a 80 mmHg.
   2. Empieza a grabar.
2. Para el registro de datos y la estimulación con un generador de estímulos digital designado, utilice un catéter de electrofisiología con electrodos de platino, una superficie de electrodo de 0,5 x 0,5 mm y un espaciado entre electrodos de 0,5 mm.
   1. Coloque el catéter cerca del área donde se colocará el corazón después de la conexión al aparato.
   2. Prepare la estimulación seleccionando 2 electrodos del catéter y utilice una duración de ciclo de 100 ms.

3. Preparación del corazón

1. Añada el tampón de perfusión frío (~2 - 4 °C) (10 - 20 mL y 40 - 50 mL, de modo que todo el plato quede cubierto) a las 2 placas de Petri (diámetros de 6 cm y 10 cm) y al plato con la cánula, y colóquelos en hielo directamente al lado y debajo del microscopio. Prepara un nudo doble alrededor de la cánula.
2. Extirpa rápidamente el corazón después de una dislocación cervical abriendo el tórax con unas tijeras Mayo y unas pinzas de patrón estrecho. A continuación, sujete la aorta y la vena cava por encima del diafragma con las pinzas de Londres y extirpe el bloqueo corazón-pulmón cortando todos los vasos y el tejido conectivo cercano a la columna vertebral con las tijeras de estrabismo.
3. Transfiera el bloqueo corazón-pulmón a la primera placa (de 6 cm de diámetro) llena con el tampón helado y retire con cuidado los pulmones sin dañar el corazón con unas tijeras de estrabismo y unas pinzas de Londres. Luego, coloque el corazón bajo el microscopio y extraiga con cuidado el timo, el esófago y la tráquea con unas tijeras Spring y unas pinzas Dumont SS.
4. Utilice las tijeras Spring para cortar un orificio de 1,5 a 2 mm en la parte superior de la aurícula derecha para la inserción del catéter. Hacer un orificio en la arteria pulmonar. A continuación, corte la aorta directamente debajo de las ramas supraaórticas y retire el tejido para que el nudo pueda adherirse fácilmente.
5. Mantenga intactas las almohadillas de grasa auricular, incluidos los plexos ganglionares principales ubicados auricularmente, alrededor de la aurícula izquierda o elimínelas por completo mediante una disección cuidadosa.
6. Transfiera el corazón al plato con la cánula y colóquelo bajo el microscopio. Tire de la aorta sobre la cánula con las pinzas Dumont SS y ate el nudo preparado firmemente alrededor de la aorta. Asegúrese de que la cánula no se coloque demasiado profundamente en la aorta para que la válvula aórtica y los vasos coronarios queden libres.
7. Coloque la cánula rápidamente en el aparato de Langendorff. Asegúrese de que no queden burbujas en la cánula.
8. Cambie la presión de perfusión a 80 mmHg, permitiendo una perfusión a presión constante.
9. Inserte el catéter con cuidado en la aurícula derecha y el ventrículo derecho sin tocar ni dañar el corazón, y fíjelo a la cánula con cinta adhesiva.
10. Inicie la estimulación con la duración del ciclo preparada de 100 ms durante un período de equilibrio inicial de 20 minutos.
11. Cierre la cámara para permitir una temperatura estable.

4. Parámetros electrofisiológicos y arritmogénesis

1. Aplique estimulación programada a través de los electrodos distales o proximales del catéter al doble del umbral de estimulación auricular o ventricular para evaluar los parámetros electrofisiológicos, como se describe en los siguientes pasos.
   1. Determine el tiempo de recuperación del nódulo sinusal como la longitud máxima del ciclo de retorno después de 10 s de estimulación de frecuencia fija a una longitud de ciclo S1S1 de 120 ms, 100 ms y 80 ms.
   2. Determine el punto de Wenckebach como la longitud de ciclo S1S1 más larga (8 estímulos; S1S1: 100 ms; 2 ms de reducción escalonada) con una pérdida de 11 AV de conducción ganglionar. Determinar los períodos refractarios ganglionares auriculoventricular como los S1S2 más largos (12 estímulos; S1S1: 120 ms, 110 ms y 100 ms; un extraestímulo acoplado corto con una reducción escalonada de S1S2 de 2 ms) con una pérdida de la conducción nodal AV.
   3. Determinar los periodos refractarios auricular y ventricular como los S1S2 más largos (12 estímulos; S1S1: 120 ms, 110 ms y 100 ms; un extraestímulo acoplado corto con una reducción escalonada de S1S2 de 2 ms) con una respuesta auricular o ventricular ausente.
2. Realizar una extraestimulación programada (S1S1: 120 ms, 100 ms y 80 ms, seguidos de hasta 3 latidos adicionales; 60 - 20 ms con una reducción escalonada de 2 ms) o protocolos de estimulación en ráfaga (5 s en S1S1: 50 - 10 ms con una reducción escalonada de 10 ms) de acuerdo con las Convenciones de Lambeth para evaluar la arritmogénesis ventricular.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	Solución Krebs-Henleit modificada
Sodium hydrogencarbonate	Sigma-Aldrich	401676	Solución Krebs-Henleit modificada
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Solución Krebs-Henleit modificada
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	Solución Krebs-Henleit modificada
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M1880	Solución Krebs-Henleit modificada
Lcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	Solución Krebs-Henleit modificada
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	Solución Krebs-Henleit modificada
Sodium pyruvate bioXtra	Sigma-Aldrich	P8574	Solución Krebs-Henleit modificada
Carbogen (95% oxígeno / 5% dióxido de carbono)	SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Alemania		Modified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22	EMD Millipore	SCGPT05RE	Modified Krebs-Henleit solution
Perfusion system	HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Alemania	73-4343	Langendorff apparatus
Sistema de adquisición de datos y software correspondiente para catéter y parámetros fisiológicos	Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, Nueva Zelanda<	Langendorff setup
Octapolar catheter	CIB'ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA	custom	Langendorff setup
Stimulus generator	STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	STG4002-160μA	Configuración de estimulación
Stimulation software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Stimulus II	Configuración de estimulación
Plastic Wrap	Parafilm M, Bemis NA, con sede en Neenah, WI, Estados Unidos		Materiales consumibles
Spring scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15003-08	Heart Preparation
Strabismus Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14575-09	Heart Preparation
Mayo Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14110-15	Heart Preparation
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11203-25	Heart Preparation
London Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11080-02	Heart Preparation
Narrow Pattern Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11003-13	Heart Preparation

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