Inducción de una lesión cerebral traumática leve en un modelo de ratón

Resumen

Fuente: Macheda, T., et. al. Modelo de cabeza cerrada controlado electromagnéticamente de lesión cerebral traumática leve en ratones. J. Vis. Exp. (2022)

Este video muestra el procedimiento para inducir una lesión de cabeza cerrada en un modelo de ratón utilizando un marco estereotáxico. El impacto controlado replica una lesión cerebral traumática leve, lo que permite a los investigadores estudiar los efectos neurológicos y la recuperación mediante la medición de los reflejos y el comportamiento posteriores a la lesión.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Surgical procedure

1. Asegure el ratón en el marco estereotáxico utilizando barras de punta cónica de resina acetáxica ligeras, una barra de mordida y una máscara de anestesia para ratones (ver Figura 1G, H). El gas isoflurano se suministra al 2%-3% en el aire ambiente a 100-200 mL/min. Controle cuidadosamente la respiración del ratón para asegurar la profundidad de la anestesia y ajustar el nivel de gas según sea necesario.
2. Aplique lubricante ocular estéril a los ojos para evitar que se seque la córnea.
3. Esteriliza el cuero cabelludo con hisopos de povidona yodada y almohadillas estériles con alcohol tres veces.
4. Asegúrese de que el ratón esté profundamente anestesiado verificando la falta de una respuesta de pellizco con los dedos de los pies.
5. Haga una incisión de aproximadamente 1 cm en la línea media del cuero cabelludo entre los ojos y el cuello con un bisturí, exponiendo el cráneo (ver Figura 1I).
6. Deja que el cráneo se seque durante 1-2 min.
7. Identifique bregma (el punto de intersección de las suturas coronal y sagital) y lambda (la intersección de las suturas sagital y lambdoidea) (ver Figura 1J).
   NOTA: Se podría usar un atlas del cerebro de ratón como referencia.
8. Coloque el aparato de soporte de la cabeza debajo de la cabeza e infle la bombilla con agua hasta que presione contra la parte inferior de la cabeza del ratón pero sin levantar la cabeza de la barra de mordida.
   NOTA: Este paso es esencial para reducir los posibles problemas de oído por la lesión de cabeza cerrada (CHI). Cualquier animal que tenga daños en la oreja causados por las barras de las orejas, que provoquen rodar o sangrar, debe ser eliminado del estudio y sacrificado.
9. Coloca el impactador sobre la cabeza del animal.
10. Extiende el impactor colocando el interruptor de palanca Extender/Retraer (en la caja de control del impactador) en el Extender.
    NOTA: Asegúrese de verificar que la punta esté completamente extendida tirando de la punta hacia abajo.
11. Alinee el impactador hasta que quede centrado sobre el bregma (ver Figura 1K).
12. Restablece las coordenadas x e y estereotáxicas digitales en el lector estereotáxico a 0 (en el control de la pantalla táctil)
13. Alinea la sonda sobre la ubicación del impacto moviendo la sonda desde el bregma hasta las coordenadas objetivo: medial-lateral = 0.0 mm, antero-posterior = −1.6 mm.
14. Sujeta el sensor de contacto a la oreja del animal.
    1. Baje lentamente la punta de la sonda con la sonda extendida hasta que se haga el primer contacto con la superficie. Detente en el pitido.
    2. Restablece las coordenadas z estereotáxicas digitales en el lector estereotáxico a 0.
15. Inspecciona cuidadosamente si la punta está al ras del cráneo (planos medial-lateral y antero-posterior).
    NOTA: Posicionar la punta de la sonda es el paso más crucial de este proceso para prevenir fracturas de cráneo y daños en el oído.
16. Retrae el impactador colocando el interruptor de palanca en la caja de control en la posición de Retracción. La punta se retira y no tiene más contacto con la cabeza del animal hasta el momento del impacto.
17. Establece la profundidad de impacto ajustando la profundidad dorsal-ventral a −1.2 mm.
    NOTA: La profundidad del impacto afecta la gravedad de la lesión. La profundidad debe ser ajustada para diferentes edades, pesos y cepas de ratones hasta la gravedad deseada de la lesión. Es posible que sea necesario ajustar / retitular la profundidad con el tiempo para mantener una gravedad constante de la lesión. La gravedad se puede evaluar neuropatológicamente: microglía y astrocitos (Inmunohistoquímica (IHQ)) y conductual: el laberinto de agua del brazo radial y la prueba de evitación activa.
18. Monitorea cuidadosamente la respiración del ratón para asegurar la profundidad de la anestesia y ajusta el nivel de gas según sea necesario.
    NOTA: A menudo, el porcentaje de gas isoflurano debe reducirse o cerrarse durante 10-20 s antes del impacto. Vigila de cerca si la respiración se acelera ligeramente. Si la respiración es demasiado lenta en el momento del impacto, el animal puede morir dentro de los primeros 60 segundos después del impacto por apnea. Esto se puede prevenir ajustando la profundidad de la anestesia en los segundos previos al impacto.
19. Inducir el impacto pulsando el interruptor de palanca derecho para impactar. La punta de la sonda desciende a la velocidad mostrada y luego permanece hacia abajo durante el tiempo de permanencia establecido y se retrae.
    NOTA: Los ratones simulados reciben un manejo idéntico al de los ratones CHI, pero el impacto no se produce.
20. Inicie el temporizador inmediatamente después de que se entregue el impacto CHI para registrar los tiempos de enderezamiento (tiempo para regresar de la posición lateral a la posición prona) o inicie el temporizador cuando el mouse se retire del marco estereotáxico para los ratones simulados. El tiempo medio del reflejo de adrizamiento es de 5-15 min.
    NOTA: Los tiempos del reflejo de adrizamiento pueden variar según la tensión y la edad del ratón.
21. Evalúe a los ratones en busca de fracturas de cráneo, hemorragias y apnea visibles. Excluya del estudio a los ratones con una fractura de cráneo deprimida o una hemorragia visible.
    NOTA: Hay niveles graduados de fracturas de cráneo. Los animales con fracturas de cráneo descomprimidas, en las que el hueso presiona notablemente el tejido cerebral, se sacrifican (primero el CO₂ y la decapitación se utiliza como método secundario). Si la punta del impactador está colocada correctamente, estos tipos de fracturas de cráneo son extremadamente raras. Si se produce una fractura de cráneo, la presentación más común es una pequeña gota de sangre en el cráneo y una ligera rugosidad táctil del cráneo, a menudo a lo largo de la sutura que conecta la punta posterior del hueso nasal. Estos ratones se anotan como posibles fracturas de cráneo en los registros, pero normalmente no se excluyen del estudio.
22. Retira al animal del marco estereotáxico.
23. Cierra el cuero cabelludo grapando la piel.
    NOTA: Se pueden utilizar suturas absorbibles o no absorbibles para cerrar el cuero cabelludo como alternativa a las grapas.
24. Aplique la pomada antibiótica triple con un aplicador estéril con punta de algodón sobre la incisión cerrada.
25. Devuelve el ratón a una jaula de retención limpia para su recuperación. La mitad de la jaula de recuperación está sobre una almohadilla térmica (configuración baja), lo que proporciona la capacidad de alejarse del calor cuando está despierto y mantiene la temperatura del animal mientras está inconsciente (ver Figura 1L).
    NOTA: El ratón se coloca de lado en la jaula de recuperación. Para evitar la asfixia, coloque al animal en una jaula de recuperación sin cama o sobre un pañuelo desechable si hay ropa de cama en la jaula.
26. Devuelve el interruptor de palanca Extender/Retraer a la posición Centro/Desactivado.
    NOTA: La corriente continuará funcionando si el interruptor se deja en la posición de extensión o retracción, lo que hace que el pistón se hinche. El impactador no funcionará hasta que el pistón se enfríe.
27. Retire el impactor de su soporte y colóquelo suavemente sobre la bolsa de hielo.
    NOTA: Mantener el impactador en una bolsa de hielo ayuda a reducir la posible hinchazón del impactador.
28. Monitoree al animal hasta que ocurra el reflejo de enderezamiento y documente el tiempo hasta el enderezamiento (ver Figura 1M).
    NOTA: El reflejo de adrizamiento se define como el momento en que el ratón vuelve a una posición prona. La jaula debe dejarse intacta; El ratón podría enderezarse si la jaula se toca, se mueve o se expone a algunos ruidos.
29. Devuelve a los ratones a su jaula de origen cuando estén despiertos y alerta. Por lo general, dentro de 1 hora después de la lesión, los animales están completamente conscientes y deambulando. Además, agregue un poco de comida húmeda en el fondo de la jaula.

Resultados

Figura 1: Paso 1: Configuración del área quirúrgica. (A) Se muestra un ejemplo del área quirúrgica y las herramientas necesarias para realizar la cirugía CHI (bolsa de hielo para el impactador, marco estereotáxico equipado con el impactador, caja de control del impactador e instrumentos quirúrgicos). (B) Una vista de cerca de la punta de la...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
9 mm Autoclip Applier	Braintree scientific	ACS- APL	Surgery
9 mm Autoclip Remover	Braintree scientific	ACS- RMV	Surgery
9 mm Autoclip, Caja de 1,000 clips	Braintree scientific	ACS- CS	Surgery (Staples)
Aperio ImageScope software	Leica BioSystems	NA	IHC
BladeFLASK Blade Remover	Fisher Scientific	22-444-275	Surgery
Cotton tip applicator	VWR	89031-270	Surgery
Cuadro estereotáxico digital del ratón	Stoelting	51730D	Surgery
Dumont #7 Forceps	Roboz	RS-5047	Surgery
Ear bars	Stoelting	51649	Surgery
EthoVision XT 11.0	Noldus Information Technology	NA	RAWM
Fiber-Lite	Dolan-Jeffer Industries	UN16103-DG	Surgery
Fisherbrand Bulb for Small Pipets	Fisher Scientific	03-448-21	Aparato
Gemini Avoidance System	San Diego Instruments	NA	Evitación
Heating Pad	Sunbeam	732500000U	Surgery prep
HRP conjugado goatat anti-rabbit IgG	Jackson Immuno Research laboratories	111-065-144	IHC
Cámara de inducción	Kent Scientific	VetFlo-0530XS	Surgery prep
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC: 11695-6777-2	Surgery
Cabeza de anestesia gaseosa de ratón holder	Stoelting	51609M	Surgery
Neuropactor Stereotaxic Impactor	Neuroscience Tools	n/a	Surgery: Formalmente distribuido por Lecia como impacto one
NexGen Mouse 500	Allentown	n/a	Postoperatorio, jaula
Parafilm	Bemis	PM992	Aparato
Peanut - Cortadora de pelo profesional	Whal	8655-200	Surgery prep
Solución de Povidona Yodada USP, 10% (p/v), 1% (p/v) disponible Yodo, para laboratorio	Ricca	3955-16	Surgery
Puralube Vet Oinment,ungüento oftálmico de vaselina, Lubricante ocular estéril	Dechra	17033-211-38	Surgery
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	IHC
Rabbit anti-IBA1	Wako	019-19741	IHC
8-arm Radial Arm Water Maze	MazeEngineers	n/a	RAWM
Scale	OHAUS CS series	BAL-101	Surgery prep
Mango de bisturí #7 Solid 6.25"	Roboz	RS-9847	Surgery
Almohadillas estériles de preparación con alcohol (alcohol isopropílico 70% v/v)	Fisher Brand	22-363-750	Surgery prep<
Kent Scientific	SS-01	Surgery
10 mL jeringa Luer-Lok Tip	BD Bard-Parker	302995	Aparato
Timers	Fisher Scientific	6KED8	Cirugía
Crema anestésica tópica	L.M.X 4	NDC 0496-0882-15	Surgery prep
Triple antibiotic ointment	Major	NDC 0904-0734-31	Post-surgery
Tubing	MasterFlex	96410-16	Aparato
Vaporizador Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	Preparación para la cirugía

de soporte para la cabeza activa de sujeción de soporte para la cabezatd style='height:15.75pt;width:283pt;'>SumnoSuite sistema de anestesia de bajo flujo de soporte para la cabeza de soporte para la cabeza