Análisis de la dinámica del calcio y los cambios potenciales en la membrana del endotelio arteriolar de un ratón

Resumen

Fuente: Hakim, M. A. et al., Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón. J. Vis. Exp. (2022).

Este video muestra el análisis funcional de un tubo endotelial arteriolar aislado del cerebro de un ratón. Describe los pasos para medir los niveles de calcio intracelular y el potencial de membrana, tanto al inicio como en respuesta a la estimulación farmacológica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Materiales y equipo

NOTA: Véase la Tabla de materiales para todos los reactivos y materiales necesarios para este protocolo. Además, también se pueden consultar los manuales y sitios web asociados con los respectivos proveedores según sea necesario.

1. Cámara de flujo
   1. Fije una cámara de superfusión con un cubreobjetos de vidrio a una plataforma compuesta de aluminio anodizado. Asegure la plataforma con la cámara en una platina de microscopio de aluminio.
   2. Coloque un micromanipulador que sostenga una pipeta de fijación en cada extremo de la plataforma en la platina del microscopio de aluminio.
      NOTA: Si es necesario, utilice un aparato de escenario transferible con una unidad de cámara de flujo para mover un tubo endotelial asegurado y aislado de un aparato de microscopio a otro para la experimentación.
2. Microscopios
   1. Configure el aparato experimental colocando un microscopio invertido (objetivos: 4x, 10x, 20x, 40x y 60x) y una platina manual de aluminio sobre una mesa de aislamiento de vibraciones.
3. Aparato de grabación intracelular V_m
   1. Conecte el electrómetro a una cabecera compatible. Utilice accesorios, como un generador de funciones y un estimulador, para los protocolos que requieren inyección de corriente.
   2. Conecte las salidas del amplificador a un sistema digitalizador de datos, un osciloscopio y monitores de referencia audibles. Asegure el electrodo de baño de referencia (pellet de Ag/AgCl) cerca de la salida de la cámara de flujo.
   3. Ensamble un sistema fotométrico con componentes integrados de una interfaz de sistema de fluorescencia, una lámpara de arco de alta intensidad y una fuente de alimentación, un hiperinterruptor, un tubo fotomultiplicador (o PMT) y una cámara para medir [Ca²⁺]_i en células endoteliales.
   4. Ensamble un controlador de temperatura equipado con un calentador en línea para elevar y mantener una temperatura fisiológica (37 °C) durante todo el experimento.
   5. Ensamble una plataforma multicanal conectada a un controlador de válvulas con una válvula de control de flujo en línea para controlar la entrega de soluciones a los tubos endoteliales asegurados en la cámara.
4. Micropipetas y electrodos afilados
   NOTA: El experimentador necesitará un extractor de vidrio electrónico y una microforja para preparar pipetas de fijación.
   1. Para asegurar el tubo endotelial en la cámara de superfusión, prepare pipetas de alfiler pulidas con calor con un extremo esférico romo (diámetro exterior: 50-70 μm) preparadas a partir de capilares de vidrio de borosilicato de pared delgada.
   2. Para registrar el V_m de una celda endotelial, prepare electrodos afilados con una resistencia de punta de ~150 ± 30 MΩ de capilares de vidrio utilizando solo el extractor de vidrio.

2. Soluciones y medicamentos

1. Solución salina fisiológica (PSS)
   1. Prepare un mínimo de 1 L de PSS utilizando 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10mM N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido etanosulfónico (HEPES) y 10 mM de glucosa.
   2. Preparar las soluciones necesarias que carecen de CaCl₂ (cero Ca²⁺ PSS) para la disección de arteriolas cerebrales y el aislamiento de los tubos endoteliales.
      NOTA: Prepare todas las soluciones en H₂O, seguido de filtración (0,22 μm). Asegúrese de que el producto final contenga un pH de 7,4 con osmolalidad entre 290 y 300 mOsm.
2. Fura-2 y agentes farmacológicos
   1. Prepare el caldo de Fura-2 AM en dimetilsulfóxido (DMSO; 1 mM). Prepare 500 μL de concentración de trabajo (10 μM) añadiendo 5 μL de material a 495 μL de PSS para la carga.
   2. Prepare al menos 50 mL de concentraciones de trabajo de agentes farmacológicos en PSS o DMSO, según corresponda.
3. Solución conductora
   1. Prepare 2 M KCl disolviendo KCl en H desionizado₂O (7.455 g de KCl en 50 mL de H₂O). Pase la solución a través de una jeringa con un filtro de 0,22 μm antes de rellenar los electrodos afilados.

3. Utilización de los tubos endoteliales arteriolares para el examen de la fisiología celular

NOTA: Los tubos endoteliales arteriolares aislados y asegurados se pueden utilizar para registros intracelulares de [Ca²⁺]_idinámica y V_m utilizando fotometría y electrofisiología de electrodos afilados, respectivamente, como se ilustró anteriormente (Figura 1). [Ca²⁺]_i y V_m pueden medirse como variables experimentales separadas o combinadas (Figura 1). Sin embargo, los tubos endoteliales arteriolares son más delicados que el endotelio arterial, y el tiempo de experimentación no debe exceder 1 h.

1. Medición de [Ca²⁺]_i
   1. Encienda el equipo y el software para [Ca²⁺]_i mientras se mantiene una superfusión continua a un caudal de 5-7 mL/min.
   2. Cargue el tubo endotelial con el Ca²⁺ colorear Fura-2 AM durante 30 min a temperatura ambiente. Lavar las células con solución de superfusión durante otros 20-30 minutos mientras se eleva gradualmente la temperatura del baño a 37 °C. Mantener la temperatura a 37 °C durante todo el experimento.
   3. Ajuste manualmente la ventana de imágenes utilizando un software de fotometría para enfocarse en ~ 20 células endoteliales (Figura 1A). En ausencia de luz, encienda el PMT en la interfaz de fluorescencia y comience la adquisición de [Ca²⁺]_i excitando Fura-2 alternativamente (≥10 Hz) a 340 nm y 380 nm mientras recoge la emisión de fluorescencia a 510 nm. Una vez que se establece un registro de referencia estable de [Ca²⁺]_i, aplique agentes farmacológicos (por ejemplo, agonistas de receptores purinérgicos) según el objetivo experimental (Figura 1B).
2. Medición de V_m
   1. Encienda el equipo y el software para los registros V_m y ajuste la velocidad de adquisición de datos (≥10 Hz) mientras mantiene la superfusión continua a un caudal de 5-7 mL/min. Aumente gradualmente la temperatura del baño a 37 °C y manténgala hasta el final del experimento.
   2. Tire de un electrodo afilado con un capilar de vidrio de borosilicato, rellénelo con KCl de 2 M y asegúrelo sobre un alambre de plata recubierto de cloruro en el soporte de pipeta conectado a un electrómetro que, a su vez, está sostenido por un micromanipulador.
   3. Mientras mira a través del objetivo 4x, use un micromanipulador para colocar cuidadosamente la punta afilada del electrodo justo sobre una celda del tubo endotelial arteriolar en el PSS que fluye en la cámara.
   4. Aumente gradualmente el aumento a 400x y vuelva a colocar la punta del electrodo según sea necesario.
   5. Usando el micromanipulador, inserte suavemente la punta de un electrodo afilado en una de las celdas del tubo endotelial y comience a registrar V_m usando un electrómetro (Figura 1A).

Una vez que el V_m es estable (−30 a −40 mV), aplique los agentes farmacológicos deseados por objetivo experimental (Figura 1C).

Resultados

Figura 1: Aplicación del tubo endotelial para el examen fisiológico de las vías relacionadas con la regulación del flujo sanguíneo. (A) Un electrodo afilado (flecha púrpura) se coloca en una celda de un tubo endotelial enfocado en la ventana de adquisición de datos para fotometría. (B) Registro representativo de Ca²⁺ utilizando fotometría Fura-2 en respuesta...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Monitores de referencia audibles	Ampol US LLC, Sarasota, FL, EE. UU	BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Capilares de vidrio de borosilicato (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Capilares de vidrio de borosilicato (electrodos afilados)	Warner Instruments	GC100F-10
BSA: Albúmina de Suero Bovino	Sigma	A7906
CaCl2: Cloruro de Calcio	Sigma	223506
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Válvula de Control de Flujo	Warner Instruments	FR-50
Interfaz del sistema de fluorescencia, lámpara ARC y fuente de alimentación, hiperinterruptor y PMT	Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA, EE. UU.	Sistemas
Generador de funciones	EZ Digital, Seúl, Corea del Sur	FG-8002
Fura-2 AM	dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	G7021
HCl: Ácido clorhídrico	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, EE. UU.)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanoácido ácido sulfónico)	Sigma	H4034
Calentador de Solución en Línea	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Cloruro de Potasio	Sigma	P9541
MgCl2: Cloruro de Magnesio	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Micromanipulador	Siskiyou	MX10
Extractor de micropipetas (digital)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 o P-1000
Microscopio (Nikon-invertido)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Microscopio ( Nikon-invertido)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Objetivos de microscopio	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) y 40X (Plan Fluor)
Plataforma de microscopio (aluminio anodizado; diámetro, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
MTA: 2-Metiltioadenosina difosfato sal trisódica	Tocris	1624
NaCl: Cloruro de Sodio	Sigma	S7653
NaOH: Hidróxido de Sodio	Sigma	S8045
Osciloscopio	Tektronix, Beaverton, Oregón, EE. UU.	TDS 2024B
Objetivos de contraste de fase	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Cámara de superfusión de plexiglás	Warner Instruments, Camden, CT, EE. UU	RC-27
Microscopios estereoscópicos	Zeiss, NY, EE. UU	Stemi 2000 & 2000-C
Filtro de jeringa (0.22 μm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Controlador de temperatura (doble canal)	Warner Instruments	TC-344B o C
Sistema de control de válvulas	Warner Instruments	VC-6
Mesa de aislamiento de vibraciones Fabricación	técnica, Peabody, MA, EE. UU	Micro-g

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