Evaluación de los niveles de neurotransmisores excitatorios en ratas inducidas por epilepsia crónica

Resumen

Fuente: Soukupová, M., et al. Microdiálisis de aminoácidos excitatorios durante registros de EEG en ratas que se mueven libremente. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra la evaluación de los niveles de neurotransmisores excitatorios extracelulares en ratas con inducción de epilepsia crónica. Después de implantar una sonda de microdiálisis en el cerebro y confirmar la ausencia de convulsiones mediante electroencefalografía (EEG), se recolecta líquido extracelular para evaluar los niveles elevados de neurotransmisores en ratas epilépticas. A continuación, se infunde una solución con alto contenido de potasio para mantener la excitabilidad neuronal y desencadenar una mayor liberación de neurotransmisores, y se recogen muestras para evaluar el pico de neurotransmisores excitatorios inducido por el potasio.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

Este protocolo está específicamente ajustado para la determinación de glutamato y aspartato en dializados cerebrales de ratas obtenidos bajo control de EEG de sesiones de microdiálisis en ratas epilépticas y no epilépticas. Muchos de los materiales descritos aquí pueden ser fácilmente reemplazados por los que uno utiliza en su laboratorio para registros de EEG o microdiálisis.

1. Montaje del dispositivo de electrodo de sonda de microdiálisis

1. Utilice un electrodo de dos trenzas de 3 canales (con una longitud de corte de al menos 20 mm del electrodo de registro y un electrodo de puesta a tierra de 10 cm de largo) y conéctelo a una cánula guía para preparar el dispositivo. Vea ejemplos de electrodo de 3 canales y cánula guía para diálisis en la Figura 1A-1B.
2. Retire (Figura 1C) e inserte (Figura 1D) la cánula guía metálica en la cánula de plástico ficticia varias veces antes de su uso para facilitar su extracción en el momento de su cambio para la sonda de microdiálisis en animales.
3. Doble los alambres retorcidos del electrodo de registro dos veces (Figura 1E-1F) para alinear los cables con la cánula ficticia de la guía y corte la punta del electrodo (Figura 1G) para que sea 0,5 mm más larga que la punta de la cánula guía (Figura 1H) usando el calibrador digital.
4. Tenga listo el anillo de silicona de 1 mm de largo (Ø 2 mm, espesor 0,3 mm; Figura 1I) e inserte la punta de la cánula guía y la punta de los electrodos retorcidos en el anillo de silicona con las pinzas (Figura 1J). Fijarlo al pie del pedestal de la cánula guía con cola polimérica de acción rápida o resina (Figura 1K). Vea el ejemplo de los dispositivos completados en la Figura 1L y la Figura 2A.
5. Esterilice el dispositivo bajo luz ultravioleta germicida durante 4 h. Gire el dispositivo cuatro veces para que cada uno de sus lados quede expuesto a la luz durante 1 h.
   Nota: Muchos electrodos caseros y sondas de microdiálisis pueden ensamblarse de manera similar. La cabeza del implante para ratas descrito anteriormente tiene las siguientes dimensiones: 7 mm de ancho x 5 mm de profundidad x 10 mm de largo desde la parte superior hasta la punta del pedestal; La punta del implante mide unos 11 mm de largo, 600 μm de diámetro y todo el dispositivo pesa entre 330 y 360 mg. El dispositivo puede reutilizarse dos o tres veces si: i) se deja una longitud suficiente del electrodo de tierra en el cráneo durante la cirugía para el uso siguiente y ii) cuando se mata al animal y se recupera el dispositivo junto con el cemento dental, se deja en acetona durante la noche, de modo que el cemento pueda desagregarse mecánicamente, y el dispositivo se lavó y esterilizó de nuevo.

2. Cirugía estereotáxica

1. Utilice un aparato estereotáxico y un soporte de clip de sonda (Figura 2B) para la implantación del dispositivo siguiendo los estándares contemporáneos para cirugías asépticas e indoloras.
   1. Anestesiar a las ratas Sprague-Dawley adultas con una mezcla de ketamina y xilacina (43 mg/kg y 7 mg/kg, i.p.) y fijarla en el marco estereotáxico. Añadir anestesia isoflurano (1,4% en aire; 1,2 mL/min) a la inyección inicial de ketamina/xilacina, ya que permite controlar la profundidad de la anestesia a tiempo. Afeita el pelaje de la cabeza del animal.
2. Frote la superficie de la piel de la cabeza con una solución a base de yodo seguida de etanol al 70% para prepararla para la cirugía aséptica.
   1. Implante el dispositivo de cánula-electrodo guía preparado en prioridad (1.1 – 1.5) en el hipocampo ventral derecho utilizando las siguientes coordenadas: barra nasal + 5.0 mm, A – 3.4 mm, L + 4.5 mm, P + 6.5 mm a bregma. Siga las técnicas estándar para las cirugías estereotáxicas.
   2. Asegúrese de que no cubra los tornillos de anclaje. Al montarlo en el aparato estereotáxico, sujete el dispositivo para la cabeza de la cánula guía, ya que puede alinearse fácilmente con el soporte de la sonda.
3. Ancle el dispositivo al cráneo con al menos cuatro tornillos de acero inoxidable atornillados en el hueso del cráneo (1 tornillo en las placas óseas frontales izquierdas y 1 tornillo en las placas óseas frontales derechas, 1 tornillo en las placas óseas parietales izquierdas y 1 tornillo en las placas óseas interparietales). Añade una gota de pegamento para tejidos, para fijar aún más cada tornillo al hueso del cráneo.
   1. Cubre la mitad de las roscas de los tornillos con cemento metacrílico. Promover la unión del cemento haciendo surcos poco profundos en el hueso para aumentar la adherencia.
4. Una vez que la punta del dispositivo esté colocada en el tejido cerebral, gire el cable del electrodo de tierra alrededor de 3 tornillos de anclaje. Cubra todos los tornillos montados y el dispositivo con el cemento dental.
5. Monitoree a los animales durante la cirugía y durante aproximadamente 1 hora después hasta que estén erguidos y se muevan alrededor de la jaula. Manténgalos en una almohadilla térmica para evitar la hipotermia. Permita que las ratas se recuperen durante al menos 7 días después de la implantación del dispositivo.
6. Monitoree a los animales al menos una vez al día durante 3 días después de la cirugía para detectar signos de dolor o angustia. Administrar a los animales la crema antibiótica (gentamicina 0,1%) cerca de la zona incisa para prevenir la infección y un analgésico (tramadol 5 mg/kg, intraperitoneal [i.p.]) durante 3 días para prevenir el dolor postquirúrgico.

3. Inducción de epilepsia del lóbulo temporal por pilocarpina y asignación de animales a grupos experimentales

1. Después de una semana de recuperación postquirúrgica, asigne los animales aleatoriamente a los grupos: (i) animales control que recibirán vehículo y (ii) animales epilépticos que recibirán pilocarpina. Utilice un número proporcionalmente mayor de animales para el grupo epiléptico, ya que no todas las ratas a las que se les administró pilocarpina desarrollarán la enfermedad.
2. Inyectar una dosis de metilescopolamina (1 mg/kg, subcutánea [s.c.]) y 30 min después, una inyección única de pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) para inducir el estado epiléptico (SE). Inyecte metilescopolamina y el vehículo (solución salina) en las ratas de control. Utilice una jeringa de 1 ml con aguja de 25G para todas las administraciones i.p.
   1. Comprueba visualmente que los animales empiecen a tener convulsiones conductuales (mover la vibrisa en 5 min, asentir con la cabeza, clonar las extremidades) y en 25 min clonar continuamente todo el cuerpo (SE).
3. Detener la EE 2 h después del inicio para tener una mortalidad de alrededor del 25% y un período de latencia promedio de aproximadamente 10 días por administración de diazepam (20 mg/kg, i.p.). Observe y registre cualquier comportamiento convulsivo que comience inmediatamente después de la inyección de pilocarpina y continúe durante al menos 6 horas a partir de entonces.
4. Administre a los animales solución salina (1 mL, i.p.) usando una jeringa de 1 mL con aguja de 25G y solución de sacarosa (1 mL, por os [p.o.]) usando una jeringa de 1 mL y una aguja de alimentación flexible de 17G durante 2-3 días después de la SE para promover la recuperación de la pérdida de peso corporal.
   1. Excluya del estudio a los animales que no alcancen el peso corporal inicial dentro de la primera semana después de la SE de pilocarpina (excepto para el grupo agudo sacrificado 24 h después de la EE, donde el seguimiento del peso corporal no es posible).
5. Asigne aleatoriamente a los animales post-EE a diferentes grupos experimentales (Figura 3): fase aguda (donde la microdiálisis tiene lugar 24 h después de la EE), latencia (7-9 días después de la EE), primera convulsión espontánea (aproximadamente 11 días después de la EE) y período crónico (comienza aproximadamente 22-24 días después de la EE, es decir, unos 10 días después de la primera convulsión). Vigile a los animales para detectar la aparición de convulsiones espontáneas.
   NOTA: Utilice los siguientes criterios de inclusión/exclusión para experimentos posteriores en ratas epilépticas: desarrollo de EE convulsivo dentro de 1 h después de la administración de pilocarpina; aumento de peso en la primera semana después de la SE y la correcta colocación de la sonda y el electrodo de microdiálisis.

4. Monitoreo y análisis del comportamiento epiléptico

1. Monitoreo a largo plazo del comportamiento epiléptico
   1. Aproximadamente 6 h después de la administración de pilocarpina (es decir, al final de la observación directa por parte de los investigadores), coloque a los animales en las jaulas domésticas limpias e inicie el monitoreo de video de 24 h.
   2. Continuar con la videovigilancia de 24 h hasta el día 5, utilizando un sistema de videovigilancia digital.
   3. A partir del día 5, conecte las ratas en sus jaulas rectangulares domésticas al sistema de grabación de EEG conectado y continúe con el monitoreo de video las 24 horas.
   4. Ajuste los parámetros en el amplificador colocado fuera de la jaula de Faraday (establezca el factor de amplificación en cada canal de acuerdo con la especificidad de la señal de EEG de cada animal) e inicie la adquisición de EEG observando la señal de EEG producida por cables no conectados. Utilice una frecuencia de muestreo de 200 Hz y un filtro de paso bajo ajustado a 0,5 Hz.
   5. Conecte el animal a los cables que sujetan la cabeza de un animal entre dos dedos estirados de una mano y atornille los conectores al pedestal del electrodo con la otra mano libre. Inicie la adquisición.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la señal esté libre de artefactos. Los artefactos comunes son los picos que superan con creces la escala.
   6. Un día antes del experimento de microdiálisis, transfiera a los animales al sistema de EEG atado equipado con cilindros de plexiglás para microdiálisis. Desconecte a los animales del sistema de anclaje EEG en la jaula doméstica atornillando los conectores del electrodo sin sujetar al animal. Coloque al animal en los cilindros altos de plexiglás.
2. Monitorización del comportamiento epiléptico un día antes y durante la sesión de microdiálisis
   1. Encienda el amplificador situado fuera de la jaula de Faraday. Abra el software de EEG. Inicie la adquisición de EEG observando la señal de EEG producida por cables no conectados.
   2. Conecte el animal al sistema de registro de EEG atado que sostiene la cabeza de un animal entre dos dedos estirados de una mano y atornilla los conectores al pedestal de electrodos con la otra mano libre. Establezca un factor de amplificación (ganancia) en cada canal del amplificador de acuerdo con la señal del electrodo de un solo animal para que la señal de EEG esté en escala. Deje que el animal explore la nueva jaula (cilindro) durante al menos 1 h bajo la observación directa del investigador.
   3. NOTA: 24 h antes del experimento de microdiálisis, las ratas se anestesian brevemente con isoflurano para el cambio de las cánulas guía a la sonda de microdiálisis. Aprovecha el momento en el que están anestesiados para conectarlos al sistema de registro de EEG.
   4. Acortar o prolongar el cable colgante de acuerdo con el producto del animal. Asegúrese de que los cables no interfieran con los movimientos del animal y la postura acostada.
   5. Compruebe el correcto encuadre de la imagen de las cámaras de vídeo. Inicie la grabación de video-EEG.
3. Identificación de convulsiones y actividad EEG
   1. Use un reproductor de software para ver los videos. Desplácese por la película 8 veces más rápido que la reproducción en tiempo real e individualice las convulsiones generalizadas (ver animal a criar con clonus de extremidades anteriores o criar y caer animales con clonus de extremidades anteriores). Reduzca la velocidad del video y observe la hora precisa del comienzo y el final de la convulsión conductual.
   2. Procesar los datos contando el número de convulsiones generalizadas observadas en 24 h de registros de vídeo y expresarlos en términos de frecuencia y duración de las convulsiones como valores medios de todas las convulsiones observadas en 24 h.
   3. Defina las convulsiones EEG como los períodos de actividad paroxística de alta frecuencia (>5 Hz) caracterizados por un incremento de amplitud >3 veces sobre el valor basal con progresión de la frecuencia de pico que dura un mínimo de 3 s o similar. Utilice el software de EEG para procesar las grabaciones de EEG sin procesar. Divida las trazas de EEG en fracciones de 1 h. Copie las fracciones de rastreo de EEG para archivarlas en el análisis automático de picos del software.
   4. Analice los datos de actividad del EEG utilizando el software de EEG y los parámetros predefinidos (4.3.3.). Realice todos los análisis de video en dos investigadores independientes que son ciegos al grupo de animales analizados. En caso de divergencia, pídales que vuelvan a examinar los datos juntos para llegar a un consenso.

5. Microdiálisis

1. Recuperación de la sondain vitro
   1. Prepare la sonda para su primer uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante, manipulándola en su funda protectora.
   2. Realice el experimento por triplicado: prepare tres tubos de ensayo de 1,5 mL cargándolos con 1 mL de solución de Ringer que contenga la mezcla de patrones (2,5 μM de glutamato y 2,5 μM de aspartato). Coloque tres tubos de ensayo de 1,5 mL cargados en el calentador de bloque ajustado a 37 °C y colóquelo en el agitador.
      NOTA: Utilice las mismas soluciones estándar para las calibraciones de cromatografía.
   3. Selle los tubos de ensayo de 1,5 mL con una película de parafina y perfore con pinzas afiladas para hacer un agujero de aproximadamente 1 mm de diámetro.
   4. Tome la sonda e insértela en el orificio hecho en la película de parafina. Sumerja la membrana al menos 2 mm por debajo del nivel de la solución. Fije aún más la sonda al tubo de ensayo de 1,5 mL con una película de parafina.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la punta no toque las paredes del tubo de ensayo de 1,5 mL.
   5. Conecte la entrada de la sonda a la jeringa montada en la bomba de infusión usando tubos fluorados de etileno propileno (FEP) y adaptadores de tubos. Opcionalmente, utilice tubos de polietileno de diámetro interior (ID) de 0,28 mm y 0,61 mm de diámetro exterior (OD) y adaptadores de tubos de colores (adaptadores de tubos rojos y azules) para las conexiones.
   6. Ponga en marcha la bomba a 2 μL/min y deje que el líquido aparezca en la punta de salida. Conecte la salida de la sonda al tubo de ensayo colector de 0.2 mL usando tubos FEP y adaptadores de tubos.
      NOTA: Utilice tubos FEP para todas las conexiones. Corta la longitud deseada del tubo con una cuchilla de afeitar. Utilice adaptadores de tubo de diferente color para la entrada y salida de la sonda. Deje que la bomba funcione durante 60 minutos. Compruebe si hay fugas y burbujas de aire. Estos no deben estar presentes.
   7. Ajuste la bomba a un caudal de 2 μL/min y comience a recoger las muestras en el lado de salida del tubo.
   8. Recoja tres muestras de perfusión de 30 min y tres muestras de igual volumen de la solución en el tubo de ensayo de 1,5 mL. Tome las muestras de igual volumen del tubo de ensayo de 1,5 ml cada 30 minutos utilizando la microjeringa sumergida en la solución estándar en el tubo de ensayo de 1,5 ml.
   9. Repita el experimento (5.1.1-5.1.8) configurando la bomba con un caudal de 3 μL/min (5.1.7) para tener una comparación de la recuperación de la sonda cuando se utilizan dos caudales de perfusión diferentes.
   10. Cuando termine, detenga la bomba y enjuague la tubería con agua destilada, etanol al 70% y empuje el aire hacia ella. Guarde la sonda en un frasco lleno de agua destilada limpia. Enjuague bien la sonda perfundiéndola a 2 μL/min con agua destilada antes del almacenamiento.
   11. Analizar la concentración del glutamato y aspartato en las muestras por cromatografía.
   12. Calcule la recuperación utilizando la siguiente ecuación:
       Recuperación (%) = (_{C perfusado} /C_{solución dializada}) x 100.
2. Sesiones de microdiálisis en ratas que se mueven libremente
   1. Procedimientos preparativos: inserción y prueba de la sonda, ajuste e inicio de la bomba de infusión
      1. Prepare las sondas de microdiálisis para el primer uso de acuerdo con la guía del usuario del fabricante y llénelas con la solución de Ringer. Corte trozos de tubo FEP de unos 10 cm de largo y conéctelos a las cánulas de entrada y salida de la sonda utilizando los adaptadores de tubo de diferentes colores.
      2. Asegúrese de que el tubo toque los adaptadores sin espacios muertos en todas las conexiones.
      3. 24 h antes del experimento de microdiálisis, anestesiar brevemente al animal con isoflurano (5% en el aire) en una cámara de inducción hasta que esté recostado. Retire la cánula del chupete de su guía con las pinzas y sujetando firmemente la cabeza del animal. Inserte la sonda de microdiálisis, dotada de una membrana de diálisis, en la cánula guía y reafirme aún más las cánulas de microdiálisis insertadas en su guía con arcilla para modelar.
         PRECAUCIÓN: No permita que la sonda toque las paredes del manguito protector de la sonda durante la extracción.
      4. Coloca al animal en el cilindro de plexiglás y déjalo explorar el nuevo ambiente. Conecte el animal al sistema de registro de EEG atado como se ha descrito anteriormente (seguir los puntos 4.2.2 y 4.2.3).
      5. Siga los movimientos de las ratas despiertas y en movimiento libre y conecte la entrada de la sonda a la jeringa de 2,5 ml con aguja de 22G desafilada que contiene la solución de Ringer utilizando los adaptadores de tubo. Empuje la solución de Ringer dentro de la sonda expulsando 1 mL de solución de Ringer en 10 s empujando continuamente el pistón de la jeringa de 2,5 mL. Compruebe si aparece una gota de líquido en la salida. La sonda ya está lista para su uso.
      6. Llene las jeringas de 2,5 mL conectadas al tubo FEP mediante adaptadores de tubo con la solución de Ringer y móntelas en la bomba de infusión. Ponga en marcha la bomba a 2 μL/min. Déjelo funcionar toda la noche.
         NOTA: Utilice la longitud deseada de todos los tubos FEP, pero calcule el volumen muerto del tubo para saber cuándo se debe iniciar la estimulación con K⁺ alto y para correlacionar los datos de cuantificación con los cambios neuroquímicos en el cerebro de los animales. Utilice la burbuja de aire creada en el tubo bajo el flujo de trabajo para calcular este tiempo.
   2. Recolección de muestras durante el registro de EEG y la estimulación de potasio
      1. Verifique la ausencia de convulsiones en las 3 h anteriores al inicio de la recolección de muestras (grabaciones de video-EEG) y continúe monitoreando la actividad de las convulsiones durante la microdiálisis.
      2. Detenga la bomba que transporta las jeringas canuladas con tubo de FEP llenas de solución de Ringer. Monte en la bomba otro juego de jeringas de 2,5 mL conectadas a un tubo FEP con adaptadores de tubo llenos con una solución de Ringer modificada que contiene 100 mM de solución K⁺.
      3. Ponga en marcha la bomba a 2 μL/min y déjela funcionar. Para un llenado más rápido del tubo, ajuste la bomba a 5 μL/min durante el tiempo de llenado. Compruebe la ausencia de burbujas de aire en el sistema. Asegúrese de que el tubo toque los adaptadores sin dejar espacio muerto en todas las conexiones.
      4. Pruebe la sonda si está lista para su uso en animales como se ha descrito anteriormente (5.2.1.5).
      5. NOTA: Si por alguna razón la sonda no funciona, cámbiela. Para estos casos, mantenga algunas sondas de microdiálisis preparadas listas para usar cerca de la estación de trabajo de microdiálisis-EEG. Desconecte al animal de los cables de EEG y anestesiarlo brevemente con isoflurano si es necesario para realizar el cambio.
      6. Conecte el tubo FEP de las jeringas llenas con solución de Ringer a la cánula de entrada de la sonda en cada animal y espere la aparición de la gota de líquido en la punta de la salida.
      7. Conecte la salida de la sonda al tubo FEP, lo que conduce a la recolección en el tubo de ensayo. Inserte el tubo FEP en el tubo de ensayo cerrado de 0,2 mL con una tapa perforada. Asegúrese de que el tubo permanezca en su lugar fijándolo con un trozo de arcilla para modelar.
      8. Continúe haciendo funcionar la bomba a 2 μL/min durante 60 min sin recoger muestras para equilibrar el sistema (muestra cero).
      9. Recoja 5 muestras consecutivas de dializado de 30 min (60 μL de volumen respectivo) en condiciones basales (perfusión con solución de Ringer normal). Guarde las muestras en hielo.
      10. Calcule el tiempo que tarda el líquido en pasar de la bomba a la cabeza del animal (depende del volumen muerto del tubo, es decir, el tiempo de burbuja de aire) y cambie el tubo FEP que va de las jeringas que contienen solución de Ringer normal a las jeringas que contienen solución de Ringer modificada (100 mM K⁺) en este momento sin detener la bomba. Compruebe la ausencia de burbujas de aire en el sistema. Deje funcionar la bomba durante 10 min. PRECAUCIÓN: En 10 min de estimulación alta de K⁺, los animales tienden a moverse frenéticamente y generalmente presentan un gran número de sacudidas de perro mojado (animales de control y fuera de convulsión) o convulsiones conductuales (animales epilépticos), así que esté preparado para intervenir para proteger los tubos y cables de la torsión.
      11. Después de 10 minutos, cambie el tubo de las jeringas que contienen 100 mM de solución de K⁺ Ringer a la solución normal de Ringer y deje que la bomba funcione. No apague la bomba durante los cambios de solución para que haya una gota del líquido en el extremo del tubo que se conectará en línea.
      12. A partir del momento en que el dializado contiene potasio alto, es decir, después de la recolección del quinto dializado posterior al equilibrio, recoja las fracciones de dializado cada 10 min (20 μL) durante 1 h. Recoja 3 muestras de dializado adicionales de 30 min y detenga la bomba. Guarde las muestras en hielo.
      13. Almacene las muestras a -80 °C después del experimento hasta el análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
      14. Repetir el experimento de microdiálisis durante 3 días consecutivos, excepto en el grupo de crisis agudas (24 h) y en el de primera crisis, en las que solo se realiza una sesión de microdiálisis 24 h después de la SE o dentro de las 24 h posteriores a la primera crisis espontánea (Figura 3).

Resultados

Figura 1. Preparación paso a paso del dispositivo a implantar.(A) Electrodo de 3 canales con electrodo de puesta a tierra de 10 cm de longitud en su funda protectora a la izquierda y cánula guía para microdiálisis a la derecha necesaria para el montaj...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3-channel two-twisted electrode	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
cánula guía	Agn Tho's, Lindigö, Suecia	MAB 4.15.IC	Material
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italia	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italia	2047420_71941	Material
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, Francia	221300288 (AIC)	Solución
Xylazine	Sigma, Milano, Italy	X1251	Material
Isoflurane-Vet	Merial, Toulouse, France	103120022 (AIC)	Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadol	Formevet, Milano, Italia	103703017 (AIC)	Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine	MSD Italia, Roma, Italia	20891077 (AIC)	Material
simplex rapid dental	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Reino Unido	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement	Shofu, Kyoto, Japón	PN1167	Material
soporte de clip de sonda	Agn Tho's, Lindigö, Suecia	p/n 100 5001	Equipo
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam	Roche, Monza, Italia	019995063 (AIC)	Material
1 mL jeringa con aguja de 25G	Vetrotecnica, Padova, Italia	3	Material
aguja de alimentación flexible para ratas 17G	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Aparato de tecnología de hierba	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, EE. UU.	M665G08	Equipo (amplificador AS40, caja principal, cables de interconexión, modelo de telefactor RPSA S40)
sistema modular de adquisición y análisis de datos MP150	Biopac, Goleta, California, EE.UU.	MP150WSW	Equipment
sistema de videovigilancia digital	AverMedia Technologies, Fremont, California, USA	V4.7.0041FD	Equipment
sonda de microdiálisis	Agn Tho's, Lindigö	Sweden MAB 4.15.1.Cu	Material
sonda de microdiálisis	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, EE.UU.	S-8010	Material
block	heater Grant Instruments, Cambridge, Inglaterra	QBD2	Equipment
stagitr	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy	711	Equipment
bomba de infusión	Univentor, Zejtun, Malta	864	Equipment
tubo de polietileno de diámetro fino	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, EE. UU	800/100/100/100	Material
adaptadores de tubo azul	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1002	Material
red tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1003	Material
2.5 mL jeringa con aguja 22G	Chemil, Padua, Italia	S02G22	Material
vial	Cronus, Labicom, Olomouc, República Checa	VCA-1004TB-100	Material
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, EE. UU.	National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum	Material
inserto de vidrio con muelle inferior	Supelco, Sigma, Milano, Italia	27400-U	Material
autosampler vial	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia	C4013-2	Material
Smartline manager 5000 controlador de sistema y unidad de desgasificación	Knauer, Berlín, Alemania	V7602	Equipment
Smartline 1000 bomba de gradiente cuaternario	Knauer, Berlín, Alemania	V7603	Equipment
Composición de la solución del Ringer	en mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
modificada Composición de la solución del Ringer	en mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
solución salina	0.9% NaCl, ph ajustado a 7.0		Solución
sacarosa solución	10% sacarosa en agua		Solución

cement . destilada