Inmunomarcaje de proteínas de membrana neuronal en un espécimen de tejido cerebral de ratón fracturado por congelación

Resumen

Fuente: Schönherr, S., et. al. Inmunomarcaje combinado optogenético y réplica de fractura por congelación para examinar la disposición específica de entrada de los receptores de glutamato en la amígdala de ratón. J. vis. exp. (2016)

Este vídeo muestra el inmunomarcaje de réplicas fracturadas por congelación de tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica. Las réplicas fracturadas y recubiertas se digieren para exponer los receptores. Se añaden anticuerpos primarios y secundarios marcados con oro para marcar receptores específicos de la membrana neuronal. La réplica está montada en una rejilla y visualizada bajo un microscopio electrónico.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Preparación de la muestra

1. Fijación cerebral
   1. Preparación del fijador
      1. Para 1 L de fijador, pesar 10 g de paraformaldehído y añadirlo a 300 ml de agua desionizada (H₂O). Calentar a 55 - 60 ºC durante ~10 min con agitación continua.
      2. Apague el fuego y agregue de 7 a 8 gotas de hidróxido de sodio (NaOH) 4 N. La solución debería aclararse en ~ 10 minutos.
      3. Deje que se enfríe a temperatura ambiente o RT, agregue 150 ml de una solución saturada de ácido pícrico y llévelo a 500 ml con H₂O desionizado.
      4. Añadir 500 ml de tampón fosfato (PB) 0,2 M. Filtrar con papel de filtro. Ajuste el pH a 7.4 con NaOH.
      5. Enfriar el fijador a 6 ºC, y guardarlo en frascos de vidrio oscuro durante no más de un día a 6 ºC.
   2. Perfusión transcardíaca
      1. Anestesiar ratones con una inyección intraperitoneal de tiopental (120 mg/kg de peso corporal). Asegúrese de que el animal esté profundamente anestesiado comprobando el reflejo de retirada del pedal, que debe estar ausente. Coloque al animal boca arriba sobre una mesa de perfusión con las cuatro extremidades atadas.
      2. Abra la pared abdominal longitudinalmente con unas tijeras de punta roma y haga dos cortes adicionales lateralmente a lo largo del borde caudal de la caja torácica para exponer el diafragma. Cortar el diafragma y cortar la pared torácica en el borde osteocartilagéneo en ambos lados. Levante el extremo caudal de la losa central de la pared torácica que contiene el esternón para exponer el corazón.
      3. Extraer el pericardio y realizar una pequeña incisión precisa en la punta del ventrículo izquierdo para permitir la cánula del aparato de perfusión. Utilice una cánula roma con un diámetro interno de 0,6 mm. Pase la cánula suavemente a través del ventrículo hasta que la punta aparezca en la aorta ascendente y asegure la cánula con una pinza. Para permitir que la sangre y las perfusiones salgan del torrente sanguíneo, haga una incisión en la aurícula derecha.
      4. Perfundir ratones por vía transcárdica utilizando una bomba peristáltica a un caudal de 5 ml/min al principio con solución salina tampón fosfato o PBS (25 mM, cloruro de sodio al 0,9% o NaCl, pH 7,4) durante aproximadamente 1 min, seguido de fijador refrigerado con hielo durante 7 min.
      5. Después de la fijación, corte la cabeza del ratón con unas tijeras y luego corte la piel a través de la línea media desde el cuello hasta la nariz. Retire el músculo para exponer el cráneo por completo.
      6. Con unas tijeras afiladas, haga un corte longitudinal a través de los huesos occipital e interparietal a partir del foramen magnum. Con unas pinzas finas, retire estos huesos para exponer todo el cerebelo. A continuación, haz otro corte longitudinal a través de los huesos parietal y frontal hasta el hueso nasal y retíralos con pinzas para exponer todo el cerebro.
      7. Con una espátula, retire el cerebro sin dañarlo y colóquelo en 0,1 M PB helado.
2. Seccionamiento y recorte de los especímenes
   1. Corta un bloque coronal de aproximadamente 5 - 6 mm con cuchillas de afeitar que contengan el área de interés. Pégalo en el soporte de la vibrográfica con un pegamento de cianoacrilato. Oriente el bloque de tejido de modo que el neocórtex quede frente a la cuchilla vibratoria. Cortar las secciones coronales que contienen la amígdala a 140 μm con el vibroscortador (Figura 1A) en PB de 0,1 M heladas y recogerlas en un plato de 6 pocillos en el mismo tampón.
   2. Bajo un microscopio estereoscópico, recorte la región de interés (en este caso, el grupo paracapsular mediodorsal de las masas celulares intercaladas de la amígdala o ITC; ver Figura 1B) del corte. Hazlo en una placa de Petri recubierta con elastómero de silicona y rellena con 0,1 M de PB, utilizando un bisturí oftálmico. Asegúrese de que los bloques recortados encajen en el orificio del espaciador (aproximadamente 1,5 mm) (Figura 1B).
   3. Mover los bloques recortados a una solución de crioprotección (30% de glicerol en 0,1 M PB) durante la noche (O/N) a 6 ºC.

2. Congelación a alta presión

NOTA: El Inmunomarcaje de Réplica de Congelación-Fractura (FRIL) consta de 6 pasos esenciales (Figura 2): 1) Congelación rápida con alta presión (a 2.300 - 2.600 bar) de la muestra. 2) Fracturamiento de la muestra. El plano de fractura generalmente sigue el núcleo hidrofóbico central de las membranas congeladas, dividiéndolas en dos medias valvas de membrana: una mitad que se encuentra adyacente al protoplasma (cara P) y una mitad que se encuentra adyacente al espacio extracelular o exoplásmico (cara E). 3) Replicación del espécimen por deposición al vacío de platino y carbono. 4) Detergente-digestión de los tejidos. 5) Marcaje de Immunogold. 6) Análisis de la réplica mediante microscopio electrónico de transmisión.

1. Preparación de portadores de cobre
   NOTA: Para ser manipulados a través de las etapas sucesivas del procedimiento FRIL, los especímenes deben montarse en soportes metálicos (oro o cobre). Estos portadores varían en tamaño y diseño según el modo de fracturación y el tipo de máquinas utilizadas. Aquí, utilizamos portadores de cobre (Figura 1B, E) y una "mesa de réplica doble" con bisagras (ver Figura 3B), que, cuando se abre, produce una fractura por tracción a través de la muestra congelada (Figura 2). Esto permite retener y replicar ambos lados de la muestra fracturada.
   1. Pule portadores de cobre con un removedor de deslustre usando una hoja de piel de gamuza.
   2. Coloque los portadores en una olla de vidrio y limpie dos veces con un detergente no iónico (pH ~ 1,5) en un baño de agua sonicante, luego lave abundantemente con agua del grifo seguida de agua desionizada y luego enjuague dos veces con etanol.
   3. Sonicar los portadores de cobre en acetona durante 15 min.
   4. Coloque los soportes sobre papel de filtro para que se sequen.
   5. Fije un anillo de cinta adhesiva de doble cara a un soporte de cobre (Figura 1C), que servirá como pozo de sujeción para el bloque recortado (portador de sujeción).
2. Congelación de la muestra
   NOTA: Manipule el nitrógeno líquido con cuidado y usando gafas adecuadas.
   1. Encienda la unidad de congelación a alta presión (Figura 1F) durante al menos 1,5 horas antes de congelar la muestra.
   2. Comience a calentar presionando el botón "CALENTADOR DE AIRE" y hornee durante 50 min. Ajuste la temperatura del aire a 80 °C.
   3. Conecte el tanque de nitrógeno a la unidad de congelación de alta presión y presione el botón "NITRÓGENO" para llenar el Dewar interior con nitrógeno líquido. Se enciende la lámpara "NIVEL DE NITRÓGENO". Comience a enfriar presionando el botón "Enfriamiento".
   4. Presione el botón "DRIVE IN" cuando se apague el "NIVEL DE NITRÓGENO". Compruebe que el sistema hidráulico mueve el pistón hacia adelante y hacia atrás 3 veces.
   5. Presione el botón "AUTO" y el botón "NITROGEN". Tan pronto como se enciende "READY", la unidad de congelación a alta presión está lista para la congelación a alta presión.
   6. Coloque un bloque recortado en el orificio de la cinta adhesiva de doble cara (Figura 1B) utilizando un bucle de alambre de platino que se haya derretido en una pipeta de vidrio.
   7. Retire el exceso de la solución crioprotectora con papel de filtro o un cepillo.
      NOTA: Este procedimiento también es importante para eliminar las burbujas de aire que pueden formarse alrededor del tejido y que podrían causar distorsión de la forma y/o ultraestructura del tejido.
   8. Bajo un microscopio estereoscópico, cubra el soporte de retención con otro soporte, de modo que el bloque de tejido quede intercalado entre los dos portadores.
   9. Inserte el sándwich portador en el portamuestras de la unidad de congelación a alta presión (Figura 1D). Inserte el portamuestras en la unidad de congelación de alta presión (con la punta hacia abajo) y asegúrelo atornillando el portamuestras.
   10. Inicie el ciclo de congelación pulsando el botón "Jet-Auto". Trabajando lo más rápido posible, retire el soporte de muestras y sumerja la punta con nitrógeno líquido en una caja aislada. Sumerja las puntas de dos pares de pinzas en el nitrógeno líquido para enfriarlas.
   11. Retire con cuidado el sándwich portador del portamuestras y colóquelo en un criovial preenfriado. Asegúrese de que los portabebés solo se manipulen con pinzas enfriadas por nitrógeno líquido. Los crioviales deben perforarse para permitir que el nitrógeno fluya fuera del vial (Figura 1G).
   12. Repita los pasos 2.2.6 a 2.2.11 hasta que se hayan congelado todas las muestras deseadas. Se pueden almacenar varios sándwiches portadores que contengan el mismo tipo de muestra en el mismo vial.
   13. Almacene los crioviales que contienen los portadores en un tanque criogénico hasta la replicación (Figura 1H).

3. Fractura por congelación y replicación

1. Preparación de los cañones de haz de electrones
   1. Antes de insertar los cañones de haz de electrones, retire el blindaje con la "placa deflectora". Coloque el "calibre de ajuste" para centrar el filamento en el mandril de pinza a través de la cubierta inferior del cátodo.
      NOTA: El extremo de mayor diámetro del calibre de ajuste se utiliza para la pistola de carbono, mientras que el extremo de menor diámetro es para la pistola de platino.
   2. Deslice el nuevo filamento sobre el manómetro hasta que "las láminas de presión" puedan sujetar los extremos del filamento, asegurándose de que la bobina del filamento no quede en ángulo.
   3. Retire el medidor de ajuste e inserte la varilla de carbono. Fíjelo apretando el mandril de la pinza del soporte de la varilla del evaporador, asegurándose de que la altura del extremo de la varilla esté en el medio de la segunda bobina desde la parte inferior. Para el cañón de platino, la altura del extremo de la varilla de platino debe estar en el centro de la segunda bobina de filamento desde la parte superior.
   4. Vuelva a colocar la placa deflectora e inserte las pistolas en la unidad de fractura por congelación. Limpie las pistolas con un chorro de arena después de su uso.
2. Configuración de la unidad de fractura por congelación
   1. Encienda la unidad de fractura por congelación (Figura 3A) girando MAINS a 1. Para obtener una descripción detallada de los procedimientos de congelación-fractura y replicación, consulte las instrucciones de funcionamiento proporcionadas por el fabricante.
   2. Antes de enfriar el dispositivo de congelación-fractura, hornee todo el sistema de enfriamiento de la unidad con aire caliente. Presione el botón "Descongelar" en el dispositivo MTC 010 (unidad de control de temperatura) (Figura 3A) y deje que el proceso de horneado se ejecute durante 45 minutos.
   3. Activar la estación de vacío. La unidad de congelación-fractura generalmente funciona en un rango de vacío de ~ ^10-6 - ^10-7 mbar.
   4. Llene el tanque de nitrógeno y conéctelo a la unidad de fractura por congelación. Verifique que el soporte de la válvula esté seco y también limpie la entrada del tanque antes de insertar el soporte de la válvula (la humedad puede interferir con el vacío y la indicación de llenado N₂ del tanque).
   5. Comience a enfriar ajustando la temperatura a -115 °C. El enfriamiento tarda unos 45 minutos.
   6. Inserte los cañones de haz de electrones y ajuste la corriente y el voltaje para alcanzar los siguientes parámetros de evaporación:
      Pistola de carbono: rotación activada, posición 90°, tasa de acumulación de carbono 0,1 - 0,2 nm/seg
      Pistola de carbono-platino: rotación desactivada, posición 60°, tasa de acumulación 0,06 - 0,1 nm/seg
      NOTA: Si se utiliza una pistola por primera vez después de cambiar la varilla de carbono o platino, Desgasificar durante 3 minutos antes de usar.

3. Fractura y replicación

   1. Inserta sándwiches portadores congelados en una tabla de doble réplica asegurándote de que todas las manipulaciones se realicen en nitrógeno líquido.
   2. Transfiera la mesa de réplica doble a un recipiente Dewar y fíjela al receptor de la etapa de muestra en un ángulo de 45°. El nivel de nitrógeno líquido siempre debe estar por encima de la mesa de doble réplica.
   3. Recoja la mesa de réplica doble con el manipulador de mesa e insértela en la unidad de fractura por congelación en la etapa fría. Espere aproximadamente 20 minutos para que la temperatura de la mesa de doble réplica se ajuste a -115 °C.
   4. Compruebe que el vacío esté por debajo ^{de 10-6} mbar y que la temperatura sea de -115 °C.
   5. Fractura el tejido mediante la rotación manual en sentido contrario a las agujas del reloj de la rueda conectada a la cubierta colocada encima de la mesa de doble réplica. Cuando la cubierta gira, obliga a la mesa de doble réplica a abrirse, fracturando el tejido.
   6. Presione el botón "Alta tensión" en el dispositivo EVM 030 (unidad de control de evaporación por haz de electrones) de la unidad de congelación-fractura (Figura 3A).
   7. Replicar las superficies expuestas del tejido fracturado (Figura 3C) por evaporación del carbono (rotación) por medio de un cañón de haz de electrones colocado en un ángulo de 90° con un espesor de 5 nm, seguido de un sombreado unidireccional con platino-carbono en un ángulo de 60° con un espesor de 2 nm. Por último, aplique una capa de carbono de 15 nm de espesor desde un ángulo de 90° (giratorio).
   8. Utilice los siguientes parámetros para la evaporación:
      1er carbono: rotación activada, posición 90°; velocidad 0,1 - 0,2 nm/seg; 5 nm
      2º carbono-platino: posición 60°; velocidad 0,06 - 0,1 nm/seg; 2 nm
      3º carbono: rotación activada, posición 90°; velocidad 0,3 - 0,5 nm/seg; 15 nm
   9. Extraiga los especímenes replicados de la unidad de fractura por congelación y transfiéralos a una placa cerámica de 12 pocillos (Figura 4A) llena de TBS ( Solución salina tamponada con tris, pH 7,4).
   10. Con un alambrón de bucle de platino, retire el tejido replicado del portamuestras (Figura 4A).
   11. Repita los pasos 3.3.1 a 3.3.10 hasta que se hayan replicado todas las muestras.

   4. SDS-digestion of the replica

   1. Transfiera la réplica a un vial de vidrio de 4 ml lleno con 1 ml de tampón de digestión SDS (2.5% Lauril Sulfato de Sodio, 20% sacarosa en 15 mM Tris, pH 8.3). Digirir durante 18 horas a 80 °C con agitación (45 golpes/min).
   2. Transfiera las réplicas a un nuevo tubo lleno de tampón de digestión SDS y guárdelas en RT.

4. Immunolabeling

NOTA: Todas las incubaciones se realizan en RT con agitación suave, excepto las incubaciones con anticuerpos.

1. Lave la réplica durante 10 minutos en tampón de digestión de dodecil sulfato de sodio (SDS) fresco.
2. Lave la réplica una vez con 2,5% de BSA (albúmina sérica bovina) en solución salina tamponada Tris o TBS durante 5 minutos, y luego 3 x 10 minutos con 0,1% de BSA en TBS.
3. Bloquee los sitios de unión no específicos en TBS con 5% de BSA durante 1 hora.
4. Aplicar anticuerpos primarios diluidos en BSA-TBS al 2%. Realice las incubaciones en una gota de 30 μl (Figura 4B) en una cámara húmeda a 15 °C durante 72 horas (Figura 4C).
   1. Para este estudio, procese ambas réplicas del tejido fracturado. Incubar una réplica con un anticuerpo policlonal de cobaya levantado contra los aminoácidos 717 - 754 del ratón GluR1 común a todas las subunidades del receptor de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico o AMPA-R (dilución: 1:200) o un anticuerpo monoclonal de ratón criado contra una proteína de fusión recombinante que cubre los aminoácidos 660 - 811 de la subunidad NR1 del receptor N-metil-D-aspartato o NMDA-R (dilución: 1:500), y un anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína fluorescente verde (dilución: 1:300).
   2. Incubar la otra réplica con un anticuerpo policlonal de conejo levantado contra un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 384 - 398 del receptor μ-opioide de rata (dilución: 1:500).
5. Lavar en TBS con 0.05% BSA (3 x 5 min.).
6. Aplicar anticuerpos secundarios. Para este estudio, utilice anticuerpos conjugados de oro (5 nm para los receptores ionotrópicos de glutamato, 10 para los receptores de μ-opioides y/o 15 nm para la proteína fluorescente amarilla Channelrhodopsin-2 o ChR2-YFP) diluidos en TBS con 2% de BSA. Diluir los anticuerpos secundarios 1:30 e incubar en una gota de 30 μl a 15 °C O/N.
7. Lavar 3 x 5 min en 0.05% BSA-TBS en RT.
8. Lavar 2 x 5 min en agua ultrapura.
9. Réplica de montaje en una rejilla de barras paralelas de 100 líneas recubierta de formvar (Figura 4D).

Resultados

Figura 1. Preparación de tejidos y congelación a alta presión. (A) El vibroscortador se utiliza para seccionar el tejido. (B) Una sección coronal del cerebro de ratón resultante que contiene la amígdala se ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Preparación
Paraformaldehyde EM grade	Agar Scientific Ltd., Reino Unido	AGR1018
Solución saturada de ácido pícrico	Sigma-Aldrich, USA<
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, Germany	1065860500
NaH2PO4-2H2O<	1063451000
NaCl	Merck Millipore, Germany	1064041000
4N NaOH	Carl Roth, Germany	T198.1
Thiopental	Sandoz, Austria	5,133
Glycerol	Sigma-Aldrich, USA<
GenPure ultrapure water system	Thermo Fisher Scientific, USA	50131235
Bomba peristáltica	ISMATEC, Alemania	ISM 930C
Filter Paper	MACHEREY-NAGEL, Germany	MN 615 1/4
Vibroslicer, VT1000S	Leica Microsystems, Austria
Bisturí oftálmico	Alcon Laboratories, USA
Cánula de perfusión<	F560088-1
Congelación
Copper carriers	Engineering Office M. Wohlwend, CH	528
Sidol Polish	Henkel, Germany
Chamois skin	Tienda de artículos para el hogar
Perforadora, 1,5mm	Stubai, Austria
Desnaturalizado ethanol	Donauchem, Austria
Acetone	Roth, Germany	9372.5
Máquina de congelación de alta presión HPM 010	BalTec, CH; now Leica Microsystems	HPM010
Microscopio estereoscópico	Olympus, Japan	SZX10
Liquid nitrogen
Cryo-vials	Roth, Germany	E309.1
CryoCane	Nalge Nunc International,USA<
CryoSleeve	Nalge Nunc International,USA<
Recipiente de almacenamiento de nitrógeno líquido	Cryopal, Francia	GT38
Detergente no iónico (Lavocid)	Werner & Mertz Professional, Germany
Fractura por congelación y replicación
Sandblaster, Mikromat 200-1	JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany	SANDURET 2- K
Siliciumcarbid SIC 360, tamaño de grano 25 - 21μ	JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany	955932
Freeze Fracture System BAF 060	BalTec, CH; now Leica Microsystems	BAF060
Placa cerámica de 12 pocillos	Gröpel, Austria	14511
Trizma base	SIGMA, USA	T1503
Trizma hydrochloride	SIGMA, USA	T3253
Cloruro de sodio	Merck, Germany	1,06,40,41,000
SDS, Lauril sulfato de sodio	Roth, Germany	5136.1
Sacarosa	Merck, Germany	1,07,68,71,000
TRIS	Roth, Germany	5429.3
Universal Hybridization Oven	Binder, Germany	7001-0050
Immunolabelling
BSA	SIGMA, USA	A9647
Anticuerpo Anti-GFP	Molecular Probes, USA	A11122
Anticuerpo anti-pan-AMPAR	Frontier Institute, Japan	pan AMPAR-GP-Af580-1
Anticuerpo anti-NMDAR1, clon 54.1	Merck Millipore, Germany	MAB363
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody	ImmunoStar, USA<
EM cabra anti-conejillo de indias, 5nm; anticuerpo secundario	BBInternational,<
EM cabra anti-conejo, 15nm; anticuerpo secundario	BBInternational,	EM. GAR15
Donkey anti-rabbit, 10nm, anticuerpo secundario	AURION, Netherlands	DAR 10nm
Copper grids, 100 Parallel Bar	Agar scientific, UK	G2012C
Incubator	Major Science, USA	MO-RC
Pioloform Powder	Agar scientific, UK	R1275
Chloroform	Roth, Germany	3313.1

de tejidostd style='width:153pt;'>P6744-1GAtd style='width:164pt;'>Merck Millipore, Germanytd style='width:153pt;'>G5516-500MLtd style='width:164pt;'>Vieweg, Germany a alta presióntd style='width:153pt;'>5015-0001td style='width:153pt;'>5016-0001td style='width:153pt;'>24216td style='width:153pt;'>EM. GAG5