Registro simultáneo de pletismografía y electromiografía en un modelo de ratón con ELA

Resumen

Fuente: Jensen, V. N., et al. Medición repetida de la actividad muscular respiratoria y la ventilación en modelos murinos de enfermedad neuromuscular. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra el método para registrar señales simultáneas de pletismografía y electromiografía en un modelo de ratón ELA que se mueve libremente. El procedimiento implica el uso de electrodos implantados y un transmisor para capturar la actividad muscular, junto con una cámara de pletismografía para monitorear los patrones de respiración, para investigar el papel de los músculos accesorios en el ratón con ELA.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparando el ratón para la cirugía

1. Elija el ratón deseado para la implantación (es decir, SOD1(G93A) o control) y pese al animal.
   NOTA: La edad y el peso recomendados para un ratón (macho o hembra) sometido a esta cirugía es P56 - P120 y ≥ 24 g, respectivamente.
2. Anestesia al ratón con isoflurano al 3,5% con un caudal de oxígeno de 2 L/min. Realice un pellizco en el dedo del pie y un pellizco en la cola para asegurarse de que el ratón esté completamente anestesiado.
3. Una vez anestesiado, retire el ratón del buzón y mantenga la anestesia a través de un cono nasal ajustando el nivel de isoflurano al 1,5% y el caudal de oxígeno a 1 L/min. Realice un pellizco en el dedo del pie y/o en la cola para asegurarse de que la anestesia se mantiene.
4. Aplica ungüento oftálmico lubricante para evitar que los ojos se sequen durante la cirugía.
5. Afeita el ratón para exponer un sitio quirúrgico entre la oreja y el hombro (Figura 1C).
6. Recorta las uñas de los pies ipsilateralmente al sitio quirúrgico para reducir la posibilidad de que el ratón arranque los cables o cause heridas al rascarse durante el proceso de curación.
7. Alterna el hisopado del sitio quirúrgico, primero con desinfectante y luego con isopropanol. Repite 2 veces más.

2. Implantando el dispositivo de telemetría para registrar la actividad de electromiografía escaleno y trapezoidal (EMG)

1. Coloque al animal debajo de un microscopio de disección, de lado sobre una almohadilla estéril que cubre una almohadilla térmica, y asegure el cono de la nariz en su lugar con cinta adhesiva. Tenga en cuenta que es mejor implantar el lado derecho para reducir la señal del electrocardiograma (ECG) que se origina en el corazón.
   NOTA: Controle la respiración y ajuste los niveles de isoflurano, si es necesario, para mantener una tasa respiratoria regular y un plano quirúrgico de anestesia adecuado.
2. Tira de la extremidad anterior hacia el pie ipsilateral a lo largo del torso.
   NOTA: Esta posición desplaza la escápula caudalmente, proporcionando acceso quirúrgico a los músculos escaleno y trapecio.
   1. Tome las pinzas curvas romas, mantenga la pata delantera ipsilateral al sitio quirúrgico y pegue la pata en su lugar (Figura 1C). Use cinta quirúrgica adhesiva fuerte para asegurarse de que la pata esté segura durante la duración del procedimiento.
3. Ponte un par de guantes quirúrgicos nuevos. Utilice el bisturí para hacer una incisión oblicua, de aproximadamente 2 cm de largo, entre el hombro y la oreja (línea roja en la Figura 1C).
4. Usando dos pinzas de laminectomía #2, una en cada mano, retire la almohadilla de grasa y separe los músculos trapecio y platisma para exponer la fascia que cubre los músculos esternocleidomastoideo y escaleno (Figura 1D y E).
5. Utilice el músculo esternocleidomastoideo pálido y el nervio frénico como puntos de referencia para identificar los músculos escalenos. Nótese que el nervio frénico corre paralelo a los músculos escalenos, mientras que el esternocleidomastoideo se encuentra inferior. Los músculos escalenos van oblicuamente desde las vértebras cervicales hasta las costillas debajo del músculo trapecio. Los cables biopotenciales se insertarán en el músculo escaleno anterior, que se puede identificar como el músculo que corre adyacente al nervio frénico (Figura 1F y G).
   NOTA: Precaución. Esta zona está muy vascularizada, por lo que hay que tener cuidado para evitar cortar la arteria subclavia. Evite dañar el nervio frénico y el plexo braquial.
6. Una vez que se hayan identificado los músculos escaleno y trapecio (Figura 1G), haga un bolsillo subcutáneo para el transmisor en la espalda del animal, entre las escápulas.
   1. Usa las tijeras separadoras de tejidos. Inserte las puntas romas justo debajo de la piel y extiéndalas hasta que se forme una abertura de bolsillo de aproximadamente 1,25 veces el ancho del transmisor (Figura 1H).
      NOTA: El transmisor debe insertarse con una resistencia mínima, pero el bolsillo no debe ser tan grande que el transmisor pueda moverse por sí solo. Si el bolsillo es demasiado pequeño, el transmisor podría rozar la piel, causando irritación que puede llevar al animal a rascarse la piel y/o sacar la correa. Si la bolsa es demasiado grande, podrían formarse seromas o el transmisor podría migrar a una posición desfavorable.
7. Enjuague con solución salina tibia y estéril e inserte el transmisor con el lado más plano contra el músculo. Coloque el transmisor de manera que quede plano y los cables salgan de la cavidad, paralelos entre sí en lugar de retorcidos (Figura 1I). Enrolle cualquier longitud excesiva de alambre debajo del dispositivo y colóquelo plano.
8. Pasa los cables desde el transmisor hasta los músculos escaleno y trapecio de modo que los dos conjuntos de cables bipotenciales queden planos y paralelos entre sí.
9. Utilice las pinzas de laminectomía para separar el escaleno anterior de los músculos circundantes e inserte una aguja de calibre 25 perpendicular a las fibras musculares a través del músculo escaleno.
   1. Inserte un cable en la punta de la aguja y luego tire de la aguja fuera del músculo, dejando atrás el cable insertado en el músculo hasta el aislamiento del cable (Figura 1J y K). Registre qué cables de color se insertan en qué músculo.
10. Coloque una pequeña gota de adhesivo de cianoacrilato en el extremo expuesto del alambre, cerca del músculo donde se inserta el cable, y deslice rápidamente la tapa del cable sobre el cable de modo que no quede ningún cable expuesto entre la tapa del cable y el músculo (Figura 2A y B).
    NOTA: Aunque es una práctica aceptada asegurar las derivaciones EMG con cianocrilato, un método alternativo es hacer un nudo de sutura de seda alrededor de la tapa de la mina.
11. Recorta el exceso de alambre distal a la tapa y aplica una gota de adhesivo de cianoacrilato en el extremo de la tapa/alambre de plomo. Dé tiempo al pegamento para que se polimerice antes de soltarlo (Figura 2C y D).
12. Siga los mismos pasos (pasos 3.10-3.12) para insertar el cable de polaridad opuesta paralelo al primero en el mismo músculo, a 1 - 2 mm de distancia del primer cable.
13. Repita los pasos 3.10 - 3.12 para insertar los cables en el músculo trapecio, que se encuentra justo antes del músculo escaleno (Figuras 1L y M).
14. Asegúrese de que los cables estén fijos en su lugar y que haya suficiente holgura para que el animal realice movimientos corporales sin tirar de ellos. Asegúrese de que cualquier exceso de plomo no empuje contra la piel, ya que esto podría causar irritación que puede hacer que el animal rasque o saque la correa. Vuelva a colocar los cables, si es necesario, para evitar cualquier posible molestia.
15. Retira suavemente la cinta que sujeta la extremidad anterior. Tire de la almohadilla de grasa hacia atrás sobre el músculo y úsela para cubrir los cables insertados. Cierre la incisión con adhesivo de cianoacrilato uniendo los colgajos de piel para que la incisión se alinee. Pellizque una parte de los colgajos de piel con las pinzas curvas y aplique una pequeña línea de adhesivo de cianoacrilato a lo largo de esta línea.
16. Inyecte 0.1 mL de carprofeno por vía subcutánea para aliviar el dolor postoperatorio mientras el animal aún está bajo anestesia.
    NOTA: Continúe administrando 0.1 mL de carprofeno una vez al día durante 1 a 2 días después de la cirugía, y luego según sea necesario después de eso.
17. Retira al animal de la nariz y colócalo en una jaula limpia en la incubadora precalentada hasta que esté despierto y se mueva alrededor de la jaula voluntariamente. Después, mantenga al animal en la incubadora durante al menos 15 minutos, controlando sus movimientos y estado de alerta.

3. Postoperator Care

1. aloja a los animales por separado después de una cirugía. Proporcione a los animales en curación gel dietético y una botella de agua.
2. Monitorea al animal durante los primeros 30 minutos después de la cirugía. Revise al animal al menos cada hora durante 5 horas después de la cirugía. En los días posteriores a la cirugía, revíselo al menos dos veces al día.
3. Esté atento a la necrosis, infección a lo largo de la incisión y dentro de la cavidad corporal que contiene el implante (es decir, calor, hinchazón y enrojecimiento), y formación de serosoma.
   NOTA: Estos signos ocurren dentro de la primera semana después de la cirugía. La figura 1N muestra un animal sano y curado un mes después de la cirugía. Aunque los registros de EMG se pueden realizar inmediatamente después de la implantación, los animales tienen al menos una semana para sanar antes de registrar la EMG y la pletismografía, ya que las señales de ECG pueden ser altas inmediatamente después de la implantación.

4. Adquisición simultánea de señales

1. de electromiografía y pletismografíaEncienda todos los equipos de adquisición, incluido el flujo de polarización.
   NOTA: El caudal para ratones se establece típicamente en 1.0 L/min.
2. Calibra la(s) cámara(s) de pletismografía usando un medidor de flujo.
   NOTA: Revise periódicamente las cámaras de pletismografía para asegurarse de que los sellos no estén agrietados o rotos. Para mantener su buen estado, cubra los sellos de goma con un lubricante como grasa para vacío una vez a la semana.
3. Calibración del transmisor de entrada según lo especificado por el fabricante.
4. Coloque el ratón en la cámara de pletismografía durante al menos 1 h para aclimatarla antes de registrar EMG y pletismografía. Usando múltiples cámaras, es posible grabar desde un ratón mientras el siguiente ratón se está aclimatando en una segunda cámara. No encienda el transmisor durante el período de aclimatación para conservar la energía de la batería (Figura 1O).
5. Antes de grabar (pero después de la calibración), encienda el transmisor colocando un imán fuerte a menos de 1 pulgada del animal implantado; una luz roja en la parte frontal del receptor indicará cuando el transmisor está encendido.
6. Comienza la adquisición usando el menú desplegable etiquetado como "Adquisición" y elige "Iniciar Adquisición". Aunque la duración del registro puede variar según el experimento, un registro típico de pletismografía y EMG dura de 1 a 3 h.
   NOTA: El transmisor tiene una frecuencia de muestreo intrínseca de 240 Hz. El software establece una velocidad más rápida de 500 Hz para interpolar entre puntos y proporcionar una forma de onda más suave. El filtro de paso bajo (que sirve como filtro de suavizado) y el filtro de paso alto del implante especifican el ancho de banda de 1 a 50 Hz para este dispositivo de telemetría. La interferencia de CA de 60 Hz no contribuye al exceso de ruido en la señal EMG porque los implantes funcionan con baterías y el animal protege el implante y los cables de los campos eléctricos. La pletismografía, la EMG y el vídeo se sincronizan automáticamente en tiempo real a través del software de adquisición.
7. Cuando finalice la adquisición, apague el transmisor con un imán y retire al animal de la cámara.

Resultados

Figure 1. Implantación de un dispositivo de telemetría para medir la EMG del músculo respiratorio. (A) Transmisores de telemetría con dos pares de cables de biopotencial para medir la EMG. Los cab...

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