Inducción de una hemorragia pontina masiva en un modelo de rata mediante inyección de sangre autóloga

Resumen

Fuente: Tang, X. et. al., Hemorragia Pontina Masiva por Inyección Dual de Sangre Autóloga. J. Vis. Exp. (2021)

Este protocolo describe la infusión controlada de sangre autóloga en la región pontina del cerebro de una rata para modelar una hemorragia pontina masiva. El propósito es simular una hemorragia cerebral localizada mediante el aumento de la presión localizada.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Animal and instruments
2. Use ratas macho Sprague-Dawley de 8 semanas de edad pesando 250 ± 10 g.
3. aloje las ratas durante al menos 7 días antes de la cirugía en condiciones ambientales controladas con una temperatura ambiente de 25 °C, humedad relativa del 65% y un ciclo de luz-oscuridad de 12/12 h.
4. Proporciona comida y agua sin límite.
5. Prepare los instrumentos (Figura 1A-E).

2. Inyecta la sangre en la protuberancia

1. Vuelve a pesar las ratas 3 días antes de la cirugía para seleccionar ratas con el peso corporal adecuado para los experimentos.
2. Durante los 3 días antes de modelar, entrene a las ratas para que caminen sobre la barra de equilibrio 3 veces al día para asegurarse de que las ratas normales puedan pasar la barra de equilibrio sin pausa.
3. Precaliente la almohadilla térmica a 37 °C antes de la anestesia.
4. Coloque un microtaladro en el soporte en el marco estereotáxico.
5. Inyecte a las ratas 50 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilacina por vía intraperitoneal. Espere hasta que no haya una respuesta de pellizco de los dedos del pie.
6. Transporta a la rata al marco estereotáxico en posición prona. Coloque las barras para los oídos por encima del canal auditivo para asegurar la cabeza. Fije el cráneo en posición horizontal para evitar que la inyección se desvíe (Figura 1F).
7. Mantener la anestesia mediante isoflurano (97.5% de oxígeno y 2.5% de isoflurano) a través de un cono de nariz estereotáxico con un puerto de entrada y salida.
8. Use ungüento para los ojos para mantener la córnea húmeda.
9. Afeita el vello por encima del cráneo con una micro afeitadora.
10. Dibuja una línea media de 3 cm con un rotulador en el cráneo desde la línea del canto lateral bilateral hasta 0,5 cm detrás de la fontanela posterior, como se muestra en la Figura 1F.
11. Aplique el exfoliante quirúrgico Entoyodine de forma circular, comenzando en el centro de la línea media marcada y girando hacia afuera.
12. Coloque el paño quirúrgico.
13. Haz una incisión con un bisturí a lo largo de la línea media marcada.
14. Use un hisopo de algodón para eliminar cualquier sangre potencial.
15. Coloque un trozo de pinzas a cada lado del colgajo del cuero cabelludo para exponer el cráneo (Figura 1G).
16. Sumerge un bastoncillo de algodón en solución salina al 0.9% y retira suavemente los tejidos conectivos del hueso del cráneo para evitar que los tejidos conectivos queden atrapados en el microtaladro.
17. Marca el punto central del bregma como el punto de origen con un rotulador.
18. Realice una craneotomía (1 mm de diámetro) utilizando un microtaladro a AP-9.0 mm, Lat 0 mm (Figura 2B y Tabla 1). Proceda con cuidado porque este punto está muy cerca del seno venoso (Figura 1G).
19. Retira el microtaladro del marco estereotáxico.
20. Coloque una jeringa Hamilton de 100 μL en el soporte estereotáxico (Figura 1K). Encienda el interruptor de la bomba de inyección, haga clic en el botón de inhalación rápida, aspire la solución de heparina (12500 U diluida en 100 mL de solución salina) a 100 μL y luego drene completamente para evitar la coagulación de la sangre demasiado rápido.
21. Aplique clorhexidina y un exfoliante quirúrgico con alcohol al 75% en toda la cola desde la raíz hasta la punta al menos 3 veces para desinfectar la piel, suavizar la córnea y dilatar la vena de la cola para aumentar la tasa de éxito de la inyección.
22. Conecte una acupuntura del cuero cabelludo a una jeringa de 1 mL.
23. Inserte la acupuntura del cuero cabelludo en una vena lateral de la cola a 3 cm de la punta de la cola y tome 150 μL de sangre (Figura 1H).
24. Retire la acupuntura del cuero cabelludo de la jeringa de 1 mL.
25. Transfiere la sangre a un tubo (Figura 1I).
    NOTA: Transfiera rápidamente para evitar la coagulación de la sangre.
26. Cambia los guantes quirúrgicos.
27. Elija el modo Retirar, ajuste el volumen a 100 μL, ajuste la velocidad a 200 μL/min, haga clic en el botón RUN y aspire 100 μL de sangre en la jeringa Hamilton (Figura 1J).
28. Elija el modo de infusión y ajuste la velocidad a 1 μL/min.
29. Avance la jeringa hasta que la punta alcance 9,2 mm por debajo de la superficie del cerebro (Figura 2C y Figura 1L).
30. Haga clic en el botón Run para inyectar los primeros 10 μL de sangre a una velocidad de 1 μL/min (Tabla 1).
31. Detenga la inyección y deje la jeringa en posición durante 20 minutos para evitar que la sangre fluya hacia el espacio subaracnoideo.
32. Retraiga la jeringa hasta que la punta llegue a 9.0 mm por debajo de la superficie del cerebro.
33. Reinicie la inyección a la misma velocidad de 1 μL/min hasta que la sangre residual se haya inyectado por completo.
34. Deje la jeringa en posición durante 10 minutos para evitar el reflujo de sangre.
35. Retire la jeringa del cerebro lentamente.
36. Use cemento óseo para cubrir el orificio de la craneotomía.
37. Cuando el cemento se seque, sure la herida con un filamento de sutura de poliamida 4-0. Después de coser 3 o 4 puntos, ate 2-1-1 nudos quirúrgicos estándar.
38. Para prevenir la infección, inyecte a la rata penicilina (0.25 mL, 80 UI diluida en 4 mL de solución salina) por vía intraperitoneal.
39. Inyecte a las ratas por vía subcutánea con tartrato de butorfanol (2,5 mg/kg) y repita la inyección cada 2 horas para aliviar el dolor postoperatorio hasta 24 horas después de la cirugía.
40. Observa a la rata cada 15 minutos hasta que se recupere completamente de la anestesia. Devuélvelo a la jaula original, con una almohadilla térmica debajo de la jaula. Proporcione a la rata acceso libre a comida y agua hasta el sacrificio.

Tabla 1: Inyección de sangre autóloga.

	Mild	Moderate	Massive
Total volume	30 μL	60 μL	100 μL
First injection
Stereotactic coordinates	AP -9.0 mm; Lat 0; Vert -9.2 mm
Volume	10 μL	10 μL	10 μL
Speed	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
Interval time	20 min	20 min	20 min
second injection
Stereotactic coordinates	AP -9.0 mm; Lat 0; Vert -9.2 mm		AP -9.0 mm; Lat 0; Vert -9.0 mm
Volume	20 μL	50 μL	90 μL
Speed	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
Before withdrawal of the needle	10 min	10 min	10 min
AP: posición anteroposterior
Lat: lateral
Vert: vertical

Resultados

Figura 1: Instrumentos y procedimiento de cirugía. (A) Máquina de anestesia. B) Instrumental quirúrgico. (C) Microtaladro. (D) Bomba de microinyección. E) Aparato estereotáxico. (F) Se marca una línea en el centro del cráneo. (G) La flecha amarilla apunta a la ubicación del taladro. (H) Drenaje de sangre de la vena de la cola. (I) ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
100ml solución salina	Guangdong yixiang	191222201 C1	Preparando diluyente
100μl Microinjector	Shanghai Gaoge		Inyección de sangre
1ml Jeringa	Jiangsu Zhiyu	20191014	Retire sangre autóloga de la vena de la cola
75% Alcohol	Shandong Lierkang		Desinfección de rata tail
Adhesive tape<		Surgicl instruments
Animal anesthesia system	RWD	R510-31S-6	Inducing and keeping anesthesia
Balance beam	Jiangsu Saiangsi		Para puntuaciones de déficit neurológico
Bone cement<	20180306	Instrumentos quirúrgicos
Butorphanol tartrate	Jiangsu Hengrui		For pain management
Taladro craneal eléctrico	Nanjing Darwin biotechnology	20180090018	Haciendo un agujero de rebaba en el cráneo
EP tube	Nantong Surui		Transferir sangre
Erythromycin eye cream	Yunnan pharmacy		Protección ocular
Heating pad	Dangerous Jungle	JR01	Keeping warm
Inyección de heparina sódica	Chengdu Haitong Pharmacal Company	190701	Preparando diluyente
IndoPhors	Guoyao of China		Esterilización
Isoflurane	RWD	20080701	Inducir y mantener la anestesia
Micro-injection pump	Baoding Leifu	TFD03-01-C	Inyección de sangre
Needle holder	Shanghai Jinzhong	J32020	Surgicl instruments
Penicilin	Guoyao of China		Infection Prevention
Q-tips	Jiangxi Songhe		Surgicl instruments
Scalp needle	Jiangxi Hongda	20200313	Retire sangre autóloga de la vena de la cola
Scalpel	Shanghai Kaiyuan	170902	Surgicl instruments
Shearing scissors	Shanghai Jinzhong	Y00040	Surgicl instruments
Stereotaxic apparatus	RWD	900-00001-00	For surgical positioning
Surgical towel	Xinxiang Huakangweicai	20070601	Surgicl instruments
Suture needle	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
Suture scissors	Shanghai Jinzhong	J25041	Surgicl instruments
Tissue holding fórceps	Shanghai Jinzhong	J31080	Instrumentos quirúrgicos

de heparina autólogatd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:bottom;'>Shanghai Jinzhongtd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:bottom;'>Shanghai Xinshijiautólogade heparinaautóloga