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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Montaje de las gafas para ratones
- Prepare las piezas necesarias para montar las gafas (Figura 1a). Para cada ratón, prepare todo lo siguiente: un palo de nailon montado en la cabeza, un marco de titanio superior y otro inferior, dos lentes con las potencias adecuadas según el propósito del experimento, un tornillo de tamaño M1.4 con una longitud de 10 mm, una tuerca para tornillo de tamaño M1.4, una arandela lisa para tornillo de tamaño M1.4 con un grosor de 0,3 mm, y dos puntas de uñas artificiales. NOTA: Existen dos tipos de monturas con diferentes alturas. Para un ratón, se utiliza un fotograma superior y un fotograma inferior como conjunto. Los marcos más altos deben colocarse por encima de los inferiores para que los campos de visión sean simétricos. Las monturas y lentes están especialmente diseñadas y fabricadas por el grupo de investigación de los autores. Estos pueden consultarse poniéndose en contacto con los autores correspondientes de este artículo. Otras piezas se pueden encontrar en tiendas de herramientas al por menor.
- Ensambla el marco para el ojo derecho e izquierdo por separado.
- Acomoda la punta de la uña hacia el exterior para lograr el mejor efecto protector. Ajuste el ángulo entre la punta de la uña y el marco para que sea de aproximadamente 130° para evitar enmascarar el campo de visión del mouse (Figura 1b). Adherir las puntas de las uñas artificiales al marco con adhesivo de cianocrilato.
NOTA: Las puntas de las uñas pueden ayudar a proteger la lente de los arañazos del ratón. La dirección de las puntas de las uñas debe ser opuesta porque el marco superior y el marco inferior se utilizan para el ojo derecho y el ojo izquierdo, respectivamente. - Espere al menos 12 h para que el adhesivo se seque completamente, luego use un cortaúñas para ajustar la forma de las puntas de las uñas para que sea de aproximadamente 1 cm × 1 cm cortando y recortando.
- Adhiera la lente al marco con adhesivo de cianoacrilato. Coloque la lente en el marco con la mano y sostenga el marco horizontalmente. Inyecte el adhesivo de cianoacrilato desde el borde de la lente y deje que el adhesivo se extienda por tensión superficial.
NOTA: El adhesivo erosionará la lente e influirá en su transparencia, así que asegúrese de que el adhesivo solo toque la parte periférica de la lente. Utilice lente plana de 0 dioptrías (D) como lente de control y lente negativa para inducir miopía. El efecto de las diferentes potencias de las lentes negativas (-10 D a -50 D) se ha descrito en otro lugar4. Para maximizar la inducción de la miopía, se recomienda una lente -30 D para inducir la miopía. La FDM también se puede inducir con el mismo dispositivo simplemente cambiando la lente en la tapa del microtubo de 1,5 mL como difusor.
- Aprieta el tornillo en el palo de nylon junto con la arandela desde el lado plano del stick. Prepare los anteojos y las varillas antes del experimento, respectivamente, y almacene los auriculares para su uso posterior (Figura 1c).
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
2. Fijación del marco en el cráneo del ratón.
- Aplica una gota de gotas oftálmicas de hialuronato de sodio purificado al 0.1% para prevenir la sequedad en cada ojo.
NOTA: Las gotas oculares en la superficie del ojo influirán en los valores de las mediciones de refracción y longitud axial. No use el colirio después de la anestesia hasta que se hayan realizado todas las mediciones. - Coloque la barbilla del ratón anestesiado en una pendiente hecha de arcilla o cualquier cosa que pueda usarse como almohada para hacer que el plano frontal del cráneo sea horizontal.
- Esteriliza el cabello y el cuero cabelludo entre las orejas y los ojos con un bastoncillo de algodón con etanol al 70%.
- Corta la piel entre las orejas y los ojos para exponer el cráneo durante aproximadamente 0.8 sq.cm usando tijeras quirúrgicas y pinzas. Use líquido de grabado dental y un hisopo de algodón para eliminar el periostio. Esterilizar las tijeras quirúrgicas y pinzas con etanol al 70% antes de la cirugía de cada ratón.
NOTA: Es posible que sea necesario cortar el cabello y usar guantes estériles. Verifique las disposiciones del comité de cuidado de animales correspondiente antes de este procedimiento. En la mayoría de los casos, el líquido de grabado dental es uno de los accesorios del sistema adhesivo dental autopolimerizable. Si el líquido de grabado dental no está disponible, use etanol al 70% en su lugar. - Ensambla un conjunto de monturas sin lente para ayudar a fijar el palo en la posición correcta. Coloque los marcos en la cabeza del mouse. Ajuste con cuidado la posición de los marcos para asegurarse de que ambos ojos estén en el centro del marco vacío.
- Utilice un sistema de adhesivo dental autocurable para fijar el palo a la cabeza del ratón. Tenga cuidado de no dejar que el líquido del sistema de adherencia fluya hacia el ojo del mouse.
NOTA: El método para utilizar el sistema de adhesivo dental autopolimerizable es diferente según los productos. Consulte las instrucciones cuidadosamente.
PRECAUCIÓN: Algunos de los reactivos en el sistema de adhesivo dental pueden ser tóxicos. - Espere unos 5 minutos y retire el marco y la tuerca con cuidado sin cambiar la posición del palo (Figura 2a).
- Inyecte 0.75 mg/kg de clorhidrato de atipamezol por vía intraperitoneal para ayudar al ratón a recuperarse de la anestesia más rápidamente. Coloque al ratón en una jaula individual hasta que se recupere por completo. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. El protocolo se puede pausar aquí.
3. Inicio de la inducción de la miopía y el mantenimiento posterior
- Espere al menos 24 h después de la cirugía para que el ratón se recupere completamente de la anestesia. Agarre el palo y colóquelo en las monturas con lentes. La inducción comienza en este punto de tiempo (Figura 2b).
NOTA: Para minimizar las molestias durante la recuperación de la anestesia y dar tiempo suficiente para que el sistema adhesivo dental se coagule, se recomienda encarecidamente colocar el marco después de que los ratones se recuperen completamente de la anestesia. El cemento de resina del sistema adhesivo cubrirá completamente el corte del cuero cabelludo. Por lo tanto, no se necesita un tratamiento postquirúrgico específico para prevenir la infección y mejorar el dolor postquirúrgico. Justo después de la primera vez que se colocan la montura, los ratones serán demasiado conscientes de la existencia de la lente y la rascarán mucho. El comportamiento bruto volverá a la normalidad después de unas horas. Los ratones con lentes se pueden mantener con la misma densidad que los ratones normales. - Retire la montura y limpie las lentes y las puntas de las uñas con bastoncillos de algodón al menos dos veces por semana para mantener la transparencia de la lente.
NOTA: No es necesario poner el ratón bajo anestesia para quitarlo y ponerlo en el marco. Proporcionar apoyo para que los ratones se sienten, en lugar de tenerlos colgados mientras trabajan con ellos, podría reducir la angustia.- Si es necesaria una medición provisional, ponga al ratón bajo anestesia y mida el ratón como se ha descrito anteriormente. La inducción puede continuar después de que el ratón se recupere de la anestesia.
- Limpia la jaula al menos dos veces por semana.
NOTA: Esto ayuda a mantener la claridad de la lente. También puede ser útil colocar una red entre el ratón y el fondo de la jaula para filtrar los restos de comida. - Monitorea el peso corporal y el comportamiento bruto. Compáralos con ratones de la misma edad que no fueron tocados durante todo el proceso experimental.
NOTA: A excepción de algunos comportamientos de rascado, no se encuentra ningún cambio significativo, incluido el peso corporal, entre los ratones experimentales con los ratones no tratados.
