Impacto de la privación y reoxigenación de oxígeno-glucosa en las interacciones célula-célula

Resumen

Fuente: Alluri, H., et.al. Privación y reoxigenación de oxígeno-glucosa como modelo de lesión in vitro por isquemia-reperfusión para el estudio de la disfunción de la barrera hematoencefálica. J. Vis. Exp. (2015).

El video demuestra el impacto de la privación de oxígeno-glucosa y la posterior reoxigenación en las células endoteliales microvasculares del cerebro de rata (RBMEC) mediante la simulación de condiciones hipóxicas y de privación de nutrientes. Estas condiciones dan lugar a la depleción de ATP, el aumento del calcio intracelular y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), que degradan las proteínas de unión celular e inducen la formación de fibras de estrés, debilitando así las interacciones célula-célula.

Protocolo

1. Siembra de células endoteliales

1. Obtener cultivos primarios de RBMECs de ratas Sprague Dawley adultas (u obtenerlos comercialmente).

2. Cultive RBMEC en placas de Petri recubiertas de fibronectina de 100 cm (50 μg/ml) utilizando el medio de crecimiento de células endoteliales del cerebro de rata. Cambie el medio cada dos días hasta que se alcance la confluencia.

3. Al alcanzar el 80-90% de confluencia, lavar suavemente las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante remolino. A continuación, las células se desprenden exponiéndolas a 1 ml de solución tibia de tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25%, equilibrada a 37 °C.

4. Incubar las células a 37 °C durante 2-5 min hasta que las células se desprendan y se dispersen. NOTA: Golpee la placa de cultivo para separar las células. Observe las células bajo el microscopio para confirmar el desprendimiento completo de las células de la superficie de la placa.

5. Agregue 5 ml de medio completo a la placa de Petri para neutralizar la tripsina. Pipetear el medio que contiene las células desprendidas y recogerlo en un tubo de centrífuga de 15 ml.

6. Centrifugar el medio que contiene células endoteliales a 220 x g durante 5 min.

7. Aspirar el sobrenadante y conservar las células que contienen el pellet. Suspenda el gránulo en 3-5 ml de medio de crecimiento de células endoteliales frescas de cerebro de rata mezclándolo suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta. A continuación, se contarán las células utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro.

8. Transfiera la suspensión celular a un sistema de portaobjetos de 8 pocillos prerrecubierto con fibronectina (50 μg/ml), 0,7 cm/pocillo con una densidad de siembra que oscila entre 10.000 y 15.000 células por pocillo. Hacer crecer las células a 37 °C hasta lograr la confluencia NOTA: Para realizar Western blots u otros experimentos, las células se pueden cultivar en placas de cultivo celular de 10 cm o en placas especiales según lo requiera el experimento.

2. Modelo in vitro de privación-reoxigenación de oxígeno y glucosa

1. Utilice el sistema de cultivo celular de hipoxia para estudiar los efectos de OGD-R en los RBMEC (ver Figura 1). Configure y calibre el sistema de cultivo celular de hipoxia antes de comenzar el experimento, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2. Retire los portaobjetos de la cámara confluente (paso 1.8) de la incubadora a 37 °C. Reemplace el medio completo en el portaobjetos de la cámara con medio de águila modificado (DMEM) desoxigenado, sin glucosa, y se colocó en la cámara de hipoxia con 95% de nitrógeno y 5% de dióxido de carbono durante 2 h a 37 °C, para representar la condición OGD.

3. Traslade las células de vuelta a la incubadora con un 95% de oxígeno, un 5% de dióxido de carbono a 37 °C y provista de medio completo para células endoteliales frescas de cerebro de rata e incube durante 1 hora más a 37 °C.

NOTA: Este paso representa una situación de reoxigenación.

Resultados

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, sin glucosa	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 pozos estériles, portaobjetos de vidrio	Thermo scientific	177402
FITC-tagged anti-rabbit secondary anticuerpo	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Cualquier otro PBS disponible puede ser utilizado