Inmunoprecipitación de cromatina nativa de células de la neurosfera

Resumen

Fuente: Méndez, F. M. et al., Inmunoprecipitación de cromatina nativa utilizando neuroesferas de tumores cerebrales murinos. J. Vis. Exp. (2018).

Este video demuestra el aislamiento de complejos proteína-ADN de células de neurosfera derivadas de un tumor cerebral de ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina nativa. En él se detallan los pasos para la preparación de la cromatina, la inmunoprecipitación, el lavado y la digestión de proteínas para liberar el ADN para su análisis posterior.

Protocolo

1. Inmunoprecipitación nativa de cromatina (ChIP)

1. Chromatin preparation
   1. Después de hacer un caldo de células de neurosfera (NS) derivadas, cultive NS en un matraz T-75 en 15 mL de medio NSC a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos con una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO₂ hasta que las NS confluenten. Una placa T-75 confluente producirá 3-5 X 10⁶ células.
   2. Cuando las células se vuelvan confluentes, centrifugar NS a 300 x g durante 5 min, decantar el sobrenadante y añadir 1 mL de medio de disociación celular. Incubar las células a 37 °C durante 5 min. Agregue 5 mL de medio y cuente las células con un hemocitómetro.
      NOTA: Se necesitan 1 x 10⁶ células por reacción de inmunoprecipitación (IP). Tenga en cuenta que también se debe incluir un suero preinmune o un control de IgG.
   3. Centrifugar el NS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a 300 x g durante 5 min, decantar el sobrenadante y resuspender el pellet NS con 1 mL de solución salina equilibrada y transferir la suspensión a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL de baja unión a proteínas.
   4. Centrifugar NS a 300 x g durante 5 min, decantar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 95 μL de tampón de digestión (50 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM CaCl₂, 0.2% de éter de octilfenilo de polietilenglicol) por 1 x 10⁶ células suplementadas con cóctel de inhibidores de proteasa a una alta concentración (1:100). Pipetea inmediatamente las células hacia arriba y hacia abajo para evitar que se aglomeren y evitar la creación de burbujas.
   5. Resuspende la nucleasa microcócica (MNasa) en glicerol al 50% para hacer una solución de 1 mg/mL (1,15 unidades/μL, almacenada a -20 °C) que se denominará caldo "1x". Haga un caldo "0,1x" haciendo una segunda dilución 1:9 con glicerol al 50% (por ejemplo, 900 μL de MNasa "1x" y 100 μL de glicerol al 50%) y guárdelo a -20 °C.
   6. Mezcla 5 μL de MNasa "0.1x" y 145 μL de tampón de digestión. Mantenga la enzima en hielo todo el tiempo. Añadir 5 μL de MNasa diluida en tampón de digestión por 1 x 10⁶ células. Agite el tubo para mezclar y colóquelo en un bloque de 37 °C durante exactamente 12 minutos. Procese las muestras una a la vez para garantizar un tiempo de incubación preciso de 12 minutos.
   7. Agregue 10 μL de 10x MNase Stop Buffer (110 mM Tris-HCl, pH 8.0, 55 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)) por 1 x 10⁶ celdas. A partir de este momento, las muestras deben mantenerse en hielo.
   8. Añade 110 μL "2x tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA)" (280 mM de NaCl, 1,8% de polietilenglicol octilfenil éter, 0,2% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 0,2% Na-desoxicolato, 5 mM de etilenglicol-bis (β-aminoethil ether)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA); almacenado a 4 °C) suplementado con cóctel de inhibidores de proteasa a alta concentración (1:100) por 1 x 10⁶ células. Mueve el tubo para mezclar.
   9. Centrifugar los tubos durante 15 min en un microfuge a 4 °C y 1700 x g. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga regular de 1,5 mL (ya no son necesarios tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas) y guárdelos en hielo. Deseche la bolita.
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2. span style='background-color:transparent;color:#000000;'>Immunoprecipitation (IP)
   1. Mezcla perlas magnéticas de Proteína A y Proteína G en una proporción de 1:1. Para cada IP, prepare 25 μL de perlas.
   2. Lave las cuentas añadiendo 1 mL de tampón RIPA (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% polietilenglicol octilfenil éter, 0.1% SDS, 0.1% Na-desoxicolato; almacenado a 4 °C) suplementado con inhibidores de la proteasa a baja concentración (1:1000).
   3. Use un imán para permitir que las cuentas se separen de la solución de lavado y decantar la solución de lavado (aproximadamente 1 min). Realice el paso de lavado dos veces.
   4. Vuelva a suspender las cuentas al volumen original utilizando tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasa (1:1000).
   5. Si es necesario, diluya la cromatina utilizando tampón RIPA suplementado con inhibidores de la proteasa (1:1000) para que cada IP tenga un volumen de 100-200 μL. Reserve el 10% del volumen utilizado por IP de cromatina para la entrada.
      NOTA: Por ejemplo, si se utilizan 200 μL por IP, se deben reservar 20 μL de cromatina diluida para la entrada. Para un total de cuatro IPs, el volumen total de cromatina debe diluirse a 820 μL.
   6. Prepara la entrada. Añadir 100 μL de tampón TE (10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) suplementado con proteinasa K (0,5 mg/mL) a la entrada e incubar la entrada a 55 °C durante 1 h.
   7. Purifique la entrada utilizando un kit de purificación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) siguiendo las instrucciones del fabricante y eluya en 50 μL de tampón de elución provisto en el kit.
   8. Mide la concentración de la entrada usando un espectrofotómetro de microvolumen y registra los resultados en un cuaderno. Pieza en bruto con tampón de elución del kit.
      NOTA: En neuroesferas de ratón, usamos aproximadamente 6 μg de ADN para cada IP.
   9. Ejecute la entrada en un gel al 1% o cargue 1 μL en un bioanalizador de ADN utilizando configuraciones estándar. Almacene el resto para utilizarlo como entrada en aplicaciones posteriores.
   10. Agregue 10 μL de perlas magnéticas de proteína A y G lavadas para cada IP e incube IP durante 1 h a 4 °C.
       NOTA: Por ejemplo, agregue 30 μL de perlas magnéticas de proteína A y G para tres IPs.
   11. Coloca las muestras en un imán y deja que las cuentas se separen. Divida la cromatina transfiriendo la cantidad previamente determinada a un nuevo tubo de 1,5 mL.
   12. Añade el anticuerpo y envuelve las tapas con una película de parafina plástica para evitar la evaporación. Incubar las muestras durante la noche a 4 °C con rotación a 20 rpm.
       NOTA: La concentración debe determinarse empíricamente siguiendo las recomendaciones del fabricante.
   13. Al día siguiente, centrifuga los tubos con una mini centrífuga a temperatura ambiente, 2000 x g, durante 10 s. A continuación, añadir 10 μL de perlas a cada IP e incubar el IP durante 3 h a 4 °C con rotación a 20 rpm.
       
3. IP Washes and Protein Digestion
   1. Agregue 150 μL de tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasa a baja concentración (1:1000) a cada IP e incube IP a 4 °C con rotación a 20 rpm durante 5 min. Coloque la muestra en un soporte magnético y permita que las perlas magnéticas se separen. Use una pipeta para eliminar el sobrenadante. Repita este paso cinco veces.
   2. Añadir 150 μL de tampón de cloruro de litio (LiCl) (250 mM de LiCl, 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.5% Na-desoxicolato; almacenar a 4 °C) suplementado con inhibidores de proteasa a baja concentración (1:1000) a cada IP e incubar IP a 4 °C con rotación a 20 rpm durante 5 min. Coloque la muestra en un soporte magnético y deje que las perlas magnéticas se separen. Use una pipeta para eliminar el sobrenadante.
   3. Añadir 150 μL de Tris-EDTA (TE) frío (sin inhibidores de la proteasa) e incubar la muestra a 4 °C con rotación a 20 rpm durante 5 min. Coloque la muestra en un soporte magnético y permita que las perlas magnéticas se separen. Use una pipeta para eliminar el sobrenadante.
   4. Después del último paso de lavado, vuelva a suspender la muestra en 100 μL de tampón TE suplementado con proteinasa K (0,5 mg/mL) e incube la muestra a 55 °C durante 1 h.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, refrigerado	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Lcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Luciferina, Sal de Potasio	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A magnetic beads
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	prepare 20 μg/mL stock en 0.1% BSA y alícuota.
Ethylenediaminetetraactic acid (EDTA)	Sigma	E-4884	buffer reagent
Ethylene glycol-bis(β-aminoethil ether)-N,N,N',N'-ácido tetraacético) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	for freezing cells
FGF	PeproTech	100-18b	Prepare 20 μg/mL de caldo en 0.1% BSA y alícuota.
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	for dissection of tumor<
Glycerol, MB Grade<	356352
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	inhalation anesthetic
Ivis Spectrum<	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	cell detachment media
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
Microtubos de unión baja	Corning Costar	CLS3207	low tubo de microcentrífuga de unión a proteínas
Microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	regular microcentrifugage tube
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix<	Cada lote puede diferir; Compre una cantidad suficiente para experimentos y alícuotas.
N2	Gibco	17502-048	NSC component<
Normocin<	NOL-36-063	agente antimicrobiano, úselo a 0.1 mg/mL.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	aliquot y almacenar a -20 °C.
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308	haga 10 mg/mL de caldo en agua; alícuota y almacene a -20 °C.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA purification kit
Scalpel	Fine Science Tools	10007-16	for dissection of tumor<
Cloruro de sodio	VWR	0241-5KG	buffer reagent
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
Sulfato de dodecilo de sodio (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	polyethylene glycol octylphenyl ether
Mini Centrífuga Estándar	Fisherbrand	12-006-901	mini centrífuga estándar
SZX16 microscope<	SZX16	flourescent dissecting microscope
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W

tr style='height:19px;'>td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>EMD- Milliporetd style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden; padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Perkin-Elmertd style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>70196Ytr style='height:19px;'>td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Invivogentr style='height:19px;'>td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Olympus