Realización de hibridación in situ de doble fluorescencia para detectar la expresión génica en secciones del cerebro de ratón

Resumen

Fuente: Jolly, S., et.al. Combinación de hibridación de doble fluorescencia in situ con inmunomarcaje para la detección de la expresión de tres genes en secciones de cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2016).

Este video demuestra el uso de la hibridación in situ de doble fluorescencia para visualizar la expresión de dos dianas de ARN en secciones del cerebro de ratón. El protocolo implica la detección secuencial de ARN mediante sondas marcadas con isotiocianato de fluoresceína y digoxigenina, seguida de la amplificación de la señal enzimática para mejorar la sensibilidad. La fluorescencia resultante permite el análisis de colocalización de los ARN diana dentro del tejido.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Hibridación

1. Prepare tampón de lavado a 65 °C: 150 mM NaCl, 15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x citrato de sodio salino), 50% (v/v) formamida y 0,1% (v/v) Tween-20.
2. Preparar tampón MABT: 100 mM de ácido maleico, 150 mM de NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20, pH 7,5.
3. Diluir las dos sondas (marcadas con DIG y marcadas con FITC) 1/1.000 en tampón de hibridación (agua desionizada tratada con DEPC con formamida desionizada al 50% (v/v), 200 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 5 mM de NaH₂PO₄, 5 mM Na₂HPO₄, 0,01 mg/ml de ARNt de levadura, 1× solución de Denhardt y 10% p/v de sulfato de dextrano) precalentado a 65 °C y mezclar bien.
4. Aplique alrededor de 300 μl de mezcla de hibridación en cada portaobjetos, cubra con cubreobjetos horneados (200 °C) e incube O/N a 65 °C en una cámara humidificada.
5. Transfiera los portaobjetos a un frasco Coplin que contenga tampón de lavado precalentado. Lave los portaobjetos durante 30 minutos dos veces a 65 °C con tampón de lavado.
6. Lave los portaobjetos durante 10 minutos tres veces con MABT en RT.

2. Visualización de la sonda FITC

1. Prepare el tampón de bloqueo ISH: MABT con un 2% de reactivo de bloqueo y un 10% de suero de oveja inactivado por calor.
2. Opcional: use un bolígrafo hidrofóbico para dibujar círculos alrededor de las secciones de tejido en el portaobjetos para reducir el volumen de soluciones de anticuerpos requeridas.
3. Incubar los portaobjetos durante 1 hora a RT con tampón de bloqueo ISH en una cámara humidificada.
4. Incubar los portaobjetos O/N a 4 °C con un anticuerpo anti-FITC conjugado con peroxidasa de rábano picante (POD) diluido 1/500 (v/v) en tampón de bloqueo ISH.
5. Coloque los portaobjetos en un frasco Coplin que contenga PBS con 0.1% (v/v) Tween-20 (PBST). Lave 3 veces durante 10 minutos en PBST y reemplácelo con PBST nuevo cada vez.
6. Inmediatamente antes de usar, prepare la tiramida fluorescente diluyéndola 100 veces en el diluyente de amplificación. Para este ejemplo, utilice FITC-tyramida.
7. Agregue esto a los portaobjetos y déjelo durante 10 minutos en RT.
8. Coloque los portaobjetos en un frasco de Coplin y lávelos 3 veces en PBST durante 10 minutos.

3. Visualización de la sonda DIG

1. Prepare 0.1 m Tris- HCl pH 8.2.
2. Incubar los portaobjetos con tampón de bloqueo de ISH durante 1 hora en RT.
3. Incubar los portaobjetos O/N a 4 °C con un anticuerpo anti-DIG conjugado con fosfatasa alcalina (AP) diluido 1/1.500 (v/v) en tampón de bloqueo de ISH.
4. Lavar con MABT durante 10 min tres veces.
5. Lavar dos veces con 0,1 M de Tris-HCl pH 8,2 durante 5 min a RT.
6. Inmediatamente antes de usar, prepare la solución de Fast Red disolviendo los comprimidos en 0,1 M Tris pH 8,2. Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μM.
7. Incubar los portaobjetos a 37 °C con solución Fast Red en una cámara humidificada. Dado que el tiempo para el desarrollo óptimo varía, revise los portaobjetos regularmente con un microscopio fluorescente para controlar la formación de precipitado. Para este ejemplo, detenga la reacción después de 2 a 3 horas.
8. Lave con PBST durante 10 minutos tres veces.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	para tampón de lavado a 65°C
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503		Tween-20
Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Suero de oveja inactivado por calor	Sigma	S2263
Hydrophobic pen	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD-conjugado antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00
α-DIG AP-conjugado	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 confocal microscope	Leica
.22 μM filter	Millex	SLGP033RS
Formamida desionizada	Sigma	F9037	para el búfer de bloqueo ISH
Cloruro de sodio	Sigma	S3014
Ácido clorhídrico	VWR International	20252.29
Sodium phosphate monobasic anhydrous	Sigma	S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	30435
Yeast tRNA	Roche	10109495001
50x La solución de Denhardt	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Acetato de sodio	Sigma	S2889
Trizma Base	Sigma	T1503