Tinción por inmunofluorescencia de tejido fibrovascular enfermo derivado del paciente incluido en gel

Resumen

Fuente: Gucciardo, E., et. al., Un modelo de cultivo de tejidos ex vivo para las complicaciones fibrovasculares en la retinopatía diabética proliferativa. J. Vis. Exp. (2019)

Este video detalla un protocolo de inmunotinción para cultivos ex vivo de tejido fibrovascular incrustado en gel de fibrina. Esto permite una visualización detallada de los cambios vasculares asociados con la retinopatía diabética proliferativa

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo

NOTA: Este protocolo dura 5 días y puede interrumpirse con incubaciones nocturnas cuando esté indicado. No dejes que los geles de fibrina se sequen en ningún momento. Todos los pasos se realizan en RT a menos que se indique lo contrario.

1. Prepare las siguientes soluciones antes de iniciar el protocolo de tinción.
   1. Solución post-fijación: prepare una solución de acetona:metanol 50:50 mezclando cantidades iguales de acetona y metanol (por ejemplo, 50 mL). Conservar a -20 °C. Preparar esta solución a más tardar el día anterior a la tinción. Esta solución puede almacenarse a -20 °C y utilizarse para tinciones posteriores.
      NOTA: Prepare esta solución en una campana extractora ya que la acetona y el metanol son inflamables y peligrosos para la salud.
   2. Solución de bloqueo: prepare una solución de suero fetal bovino (FBS) al 15% y etoxilato de octilfenol al 0,3% en PBS añadiendo primero un 15% de FBS al PBS. Agregue el etoxilato de octilfenol y revuelva para disolver. Conservar a 4 °C.
      NOTA: Esta solución puede prepararse en grandes cantidades con anticipación, almacenarse en alícuotas de 15 mL a -20 °C y descongelarse antes de usar el día en que se inicia el protocolo de tinción. Use alícuotas recién preparadas o recién descongeladas para cada protocolo de tinción.
   3. Solución de lavado: Prepare 1 L de PBS suplementado con etoxilato de octilfenol al 0.45% añadiendo 4.5 mL de etoxilato de octilfenol a 995.5 mL de PBS. Revuelva para disolver. Tienda en RT.
2. Levante las gotas con cuidado de la placa utilizando una espátula de borde cuadrado de acero inoxidable. Separe la gota primero de los bordes antes de levantar el centro y transfiérala a un pocillo de placa de 12 pocillos que contenga 1 mL de PBS.
   NOTA: Realice pasos de post-fijación, lavados y bloqueo en este formato de placa.
3. Fije las gotas con 1 mL de solución helada de acetona:metanol 50:50 durante ~1 min (el borde de las gotas se volverá blanco).
   NOTA: Realice este paso en la campana extractora ya que la acetona y el metanol son peligrosos para la salud.
4. Enjuague con 3 - 5 lavados en 2 mL de PBS (las gotas se hundirán en la solución de PBS cuando se complete la rehidratación).
   NOTA: Evite tocar las gotas con la punta de la pipeta ya que, después de la postfijación, son pegajosas al plástico. A lo largo del protocolo, evite aspirar soluciones post-fijación, anticuerpos, bloqueantes y de lavado por succión, ya que esto puede dañar o destruir completamente las gotas. En su lugar, incline la placa y retire con cuidado las soluciones con una pipeta de 500-5.000 μL.
5. Centrifugar la solución de bloqueo durante 15 min a 21.000 x g y 4 °C para eliminar los residuos.
   NOTA: La solución se puede alícuota en tubos de 1,5 mL para centrifugación. La solución no utilizada puede almacenarse a 4 °C y utilizarse para todos los pasos posteriores pertinentes.
6. Incubar las gotas en 500 μL de solución de bloqueo durante 2 h en RT.
   NOTA: Para reducir el volumen de solución de bloqueo utilizada, la placa se puede inclinar sobre un soporte y se pueden usar tan solo 300 μL de solución/gota.
7. Prepare la mezcla de anticuerpos primarios (al menos 30 μL/gota) con la dilución adecuada en solución de bloqueo y centrifugar durante 15 min a 21.000 x g y 4 °C.
8. Transfiera las gotas a una placa redonda de 96 pocillos con fondo en (U) utilizando una espátula de borde redondeado, e incube con al menos 30 μL/gota de la mezcla de anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.
9. Al día siguiente, transfiera las gotas a una placa de 12 pocillos que contenga 2 mL de solución de lavado/pocillo, enjuague con tres lavados de 5 min primero y luego con nueve lavados de 30 min. Dejar el último lavado (2 mL) toda la noche a 4 °C.
10. Al día siguiente, enjuague tres veces con PBS y transfiera las gotas a una placa redonda de 96 pocillos con fondo en (U).
11. Durante los lavados, prepare la mezcla adecuada de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos (diluida 1:500, al menos 30 μL/gota) en solución de bloqueo y centrifugar durante 15 min a 21.000 x g y 4 °C.
12. Transfiera las gotas a una placa redonda de 96 pocillos con fondo en (U) utilizando una espátula de borde redondeado e incube con al menos 30 μL de la mezcla de anticuerpos secundarios, durante 4 h en RT, protegida de la luz.
    NOTA: Realice todas las incubaciones y pasos de lavado posteriores protegido de la luz.
13. Transfiera las gotas a una placa de 12 pocillos que contenga 2 mL de solución de lavado/pocillo usando una espátula de borde redondeado, enjuague con tres lavados de 5 minutos primero y luego con cuatro lavados de 30 minutos. Dejar el último lavado (2 mL) toda la noche a 4 °C.
14. Al día siguiente, enjuague los geles con cinco lavados de 30 minutos y luego tres veces con PBS. Dejar el último lavado (2 mL) toda la noche a 4 °C.
15. Al día siguiente, transfiera las gotas a una placa redonda de 96 pocillos con fondo en (U) utilizando una espátula de borde redondeado y contratiña los núcleos incubando con 10 μg/mL de tinción nuclear de Hoechst (al menos 30 μL/gota) durante 30 minutos a RT.
    NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un medio de montaje suplementado con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la contratinción de núcleos. En cuyo caso, se omiten este paso y el paso 1.16, procediendo directamente al paso 1.17.
16. Transfiera las gotas a una placa de 12 pocillos que contenga 2 mL de PBS/pocillo usando una espátula de borde redondeado y enjuague tres veces con PBS.
17. Monta las gotas en el portaobjetos del microscopio de la siguiente manera:
    1. Aplique una capa estrecha de medio de montaje de endurecimiento rápido en los bordes de un cubreobjetos de forma cuadrada de 22 mm x 22 mm y deje secar durante ~1 minuto. Realice este paso para cada gota individualmente, para evitar un endurecimiento excesivo del medio de montaje.
       NOTA: Realice este paso en la campana extractora ya que el medio de montaje de endurecimiento rápido es peligroso para la salud.
    2. Enjuague la gota sumergiéndola en un pocillo de una placa de 12 pocillos que contenga 2 mL de agua desionizada y transfiérala a un portaobjetos de microscopio, utilizando una espátula de borde redondeado. Retira el exceso de agua utilizando un pequeño trozo de papel absorbente.
    3. Dispense 15 μL de medio de montaje antidecoloración no endurecedor sobre la gota.
       NOTA: Alternativamente, si no se ha utilizado la tinción nuclear de Hoechst, se puede utilizar un medio de montaje que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
    4. Coloque suavemente el cubreobjetos, con el medio de montaje de endurecimiento rápido hacia el portaobjetos microscópico, sobre la gota y deje que se asiente.
       NOTA: El medio de endurecimiento rápido se adherirá al portaobjetos microscópico y mantendrá la gota en su lugar.
18. Repita el paso 1.17 para todas las gotas. Monte dos gotas en cada portaobjetos del microscopio.
19. Deje secar las diapositivas al aire en RT durante ~2 h y almacene a 4 °C durante la noche. Asegúrese de que las guías estén colocadas horizontalmente y protegidas de la luz.
20. Imagine los cultivos ex vivo FT nativos o de punto final teñidos utilizando un microscopio confocal o un microscopio de epifluorescencia vertical equipado con una función de seccionamiento óptico y un objetivo de 20x o 40x. Utilice la función de mosaico para capturar un área mayor del tejido a la vez.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Material
Placas de cultivo celular, 96 pocillos, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	Utilizado para inmunofluorescencia
Espátulas redondas/planas, acero inoxidable	VWR	82027-528	Utilizado para inmunofluorescencia de montaje completo
Cubreobjetos 22x22mm #1	Menzel/Fisher<	Usado para montar
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	Used for mounting
Absorbent paper	VWR	115-0202	Usado para montar
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	Used for preparing 1x PBS
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Se utiliza para preparar la solución de postfijación. NOCIVO: use guantes y/o ropa protectora. Úselo en campana extractora.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	Utilizado para preparar la solución de post-fijación. TÓXICO: use guantes y/o ropa protectora. Úselo en campana extractora.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)	Sigma-Aldrich	T9284	Utilizado para inmunofluorescencia de montaje completo. NOCIVO: use guantes y/o ropa protectora.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	Para la contratinción de núcleos. NOCIVO: use guantes y/o ropa protectora, y protección para los ojos y/o la cara.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use guantes y/o ropa protectora, y protección para los ojos. Úselo en campana extractora.
VECTASHIELD Medio de montaje antidesvanecimiento con DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Medio de montaje con contratinción de núcleos. Use guantes y/o ropa protectora y protección para los ojos. Úselo en campana extractora.
Eukitt Quick-hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: Use guantes y/o ropa protectora y protección para los ojos. Úselo en campana extractora.
Recombinant human VEGFA	R&D Systems	293-VE-010	50 ng/ mL concentración
Recombinant human VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ mL concentración final
TGFβ	style='width:174pt;'>Millipore	GF346	1 ng/ mL concentración
Recombinant human bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ mL concentración
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	Usado en dilución 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Used at 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Used at 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleftd caspasa-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Used at 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334	Usado en dilución 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Used at 1:1500 dilución, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	R&D Systems	AF2089	Usado en dilución 1:100, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	Used at 1:100 dilución, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	Usado en dilución 1:200, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	Used at 1:40, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	Usado en dilución 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	Used at 1:400, Cy3 conjugado
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	Usado a dilución
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG	Thermo Scientific	A-11057	Usado a dilución 1:500
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	Used at 1:500 dilution	Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Molecular Probes
A-21468	Usado a una dilución
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
Microscopio de epifluorescencia invertida Axiovert 200	Zeiss		Para la obtención de imágenes del FT
AxioImager.Z1 microscopio de epifluorescencia vertical con Apotome	Zeiss		Para la obtención de imágenes de FT inmunoteñido de montaje completo

de montaje completotd style='width:160pt;'>15727582 final final final 1:500 de 1:500