Inmunotinción de neuronas en cortes de cerebro de ratón después de la hibridación fluorescente in situ

Fuente: Baleriola, J., et. al., Detección de ARNm localizados axonalmente en secciones cerebrales mediante hibridación in situ de alta resolución. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra la detección de ARNm dentro de axones colinérgicos en cortes fijos de hipocampo de ratón utilizando hibridación fluorescente in situ y tinción de anticuerpos. La microscopía de fluorescencia revela la localización espacial de los ARNm marcados con sonda y la colina acetiltransferasa en las neuronas colinérgicas.

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

Ensayo FISH seguido de inmunohistoquímica utilizando el desenmascaramiento de antígenos/ARN inducido por calor
1. Antes de comenzar, prepare todo el material necesario:
  1. Caliente el horno de hibridación a 40 °C y coloque una bandeja que contenga agua destilada en el horno para crear un ambiente humidificado.
  2. Tome una caja deslizante y coloque toallas de papel empapadas en agua destilada adentro para humedecerla. Luego, coloque la caja de deslizamiento en el horno de hibridación.
  3. Saca las sondas (tanto negativas como diana) de la nevera y caliéntalas en el horno de hibridación durante 10 minutos. Luego, deje que las sondas se enfríen en RT.
  4. Equilibre los reactivos de amplificación AMP 1-4 (incluidos en el kit de reactivos multiplex fluorescentes) en RT.
  5. Prepare la solución de recuperación de antígenos: 10 mM de citrato de sodio (pH 6), 0.05% Tween 20. Nota: La solución puede almacenarse en RT indefinidamente y usarse para tinciones futuras.
  6. Prepare 1 tampón de lavado, diluyendo la solución madre 50x (en el kit de reactivos fluorescentes multiplex) en agua libre de RNasa o tratada con DEPC.
    NOTA: El tampón de lavado 1x se puede almacenar en RT durante 1 mes y usarse para tinciones futuras. El tampón de lavado 50x podría precipitar. Si es así, caliente el tampón de lavado 50x a 40 °C durante 10 min antes de preparar la solución 1x.
2. Retire los portaobjetos de etanol al 100% y séquelos al aire durante 5 minutos en RT.
3. Prepare un frasco de coplin que contenga 50 ml de solución de recuperación de antígenos. Sumerja los portaobjetos en la solución de recuperación de antígenos y hiérvalos durante 10 minutos en un horno microondas.
  NOTA: Alternativamente, coloque los portaobjetos horizontalmente en un plato de vidrio redondo de 100 mm de diámetro que contenga 100 ml de solución de recuperación.
  1. Llena un vaso de precipitados de 1 litro con agua destilada y colócalo en el microondas.
    NOTA: El agua "amortiguará" el calor al realizar el desenmascaramiento.
  2. Coloque los portaobjetos en la solución de recuperación de antígenos dentro del microondas. Hervir los portaobjetos a alta potencia durante 5 min. Inmediatamente después de que las muestras hayan dejado de hervir, se calientan de nuevo a alta potencia durante 5 minutos adicionales.
  3. Enfríe los portaobjetos en RT.
    NOTA: PASO CRÍTICO: la duración y el procedimiento de ebullición deben ser determinados por el usuario, dependiendo de las características del microondas. Cuanto más rápido comience la ebullición, mayores serán las posibilidades de evaporación de la solución. En este caso, se recomienda hervir las muestras durante períodos de tiempo más cortos más de dos veces para completar un tiempo total de desenmascaramiento de 10 minutos. Por el contrario, si el calentamiento se realiza a media o baja potencia, el desenmascaramiento se puede realizar una vez durante 10 min. Sin embargo, si las muestras no hierven continuamente durante un total de aproximadamente 10 minutos, esto podría resultar en el desenmascaramiento parcial tanto del ARN objetivo como de la proteína que se va a detectar.
4. Lave los portaobjetos tres veces con 1x PBS.
5. Agregue 2 a 3 gotas (~100 μl) del conjunto de sondas dapB a los cortes de cerebro utilizados para evaluar la tinción de fondo. NOTA: El set de sondas dapB se dirige a un gen bacteriano y no debería reconocer ningún ARN de mamíferos.
6. Agregue 2 a 3 gotas del conjunto de sondas de orientación a los cortes de cerebro utilizados para detectar el ARN de interés. NOTA: un conjunto de sondas que apunta a los residuos 20 - 1.381 del ratón Atf4 ARNm se utiliza en este ejemplo.
7. Cubra los portaobjetos con parafilm para evitar la evaporación de la sonda, colóquelos en la caja de portaobjetos humidificada dentro del horno de hibridación e incube a 40 °C durante 2 horas.
  NOTA: OPCIONAL: se pueden hibridar cortes de cerebro adicionales con un conjunto de sondas dirigidas al ratón Polr2A y usarse como controles positivos.
8. Lave los portaobjetos dos veces con 1x tampón de lavado durante 2 min en RT.
9. Añada 2 - 3 gotas de reactivo de amplificación AMP 1-FL a cada corte de cerebro, cubra los portaobjetos con parafilm, colóquelos en la caja de portaobjetos e incube a 40 °C durante 30 min en el horno de hibridación.
10. Lave los portaobjetos dos veces con 1x tampón de lavado durante 2 min en RT.
11. Añada 2 - 3 gotas de reactivo de amplificación AMP 2-FL a cada corte de cerebro, cubra los portaobjetos con parafilm, colóquelos en la caja de portaobjetos e incube a 40 °C durante 15 min en el horno de hibridación.
12. Lave los portaobjetos dos veces con 1x tampón de lavado durante 2 min en RT.
13. Añada 2 - 3 gotas de reactivo de amplificación AMP 3-FL a cada corte de cerebro, cubra los portaobjetos con parafilm, colóquelos en la caja de portaobjetos e incube a 40 °C durante 30 min en el horno de hibridación.
14. Lave los portaobjetos dos veces con 1x tampón de lavado durante 2 min en RT.
15. Añada 2 - 3 gotas de reactivo de amplificación AMP 4-FL a cada corte de cerebro, cubra los portaobjetos con parafilm, colóquelos en la caja de portaobjetos e incube a 40 °C durante 15 min en el horno de hibridación.
16. Lave los portaobjetos dos veces con 1x tampón de lavado durante 2 min en RT y dos veces con 1x PBS.
17. Añadir 100 - 200 μl (o volumen suficiente para cubrir completamente las rodajas) de una solución de bloqueo que contenga 3 mg/ml de BSA, 100 mM de glicina y Triton X-100 al 0,25% en PBS (pH 7,4) a los portaobjetos, cúbralos con parafilm e incube durante 30 minutos a RT.
18. Añada 100 - 200 μl de anticuerpo anti-ChAT diluido en solución de bloqueo (1/100) a los portaobjetos, cubrirlos con parafilm e incubar durante 2 días a 4 °C. Asegúrate de que los trozos de cerebro no se sequen. Si es necesario, vuelva a aplicar la solución de anticuerpos anti-ChAT en cortes de cerebro 24 horas después de la incubación.
19. Lave los portaobjetos tres veces en 1x PBS durante 5 minutos en RT.
20. Agregue 100 - 200 μl del anticuerpo secundario conjugado con Alexa apropiado (e.g., Alexa-594 burro anti-cabra para este ejemplo en particular) a los portaobjetos, cúbralos con parafilm e incube durante 1 hora en RT.
21. Lave los portaobjetos tres veces en 1x PBS durante 5 min en RT.
22. Lave los portaobjetos una vez con agua destilada.
23. Monte las guías con un medio de montaje que contenga DAPI.
24. Visualice cortes de cerebro bajo un microscopio de fluorescencia.

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Custom probe targeting fossils 20-1381 del ratón Atf4 mRNA (NM_009716)	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Sonda personalizada dirigida a los residuos 15-1256 del ARNm ATF4 humano (NM_001675.2)	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Sonda de control negativo-DapB	Advanced Cell Diagnostics	310043	Probe
Sonda de control positivo-ratón Polr2A (opcional)	Advanced Cell Diagnostics	312471	Probe
Goat polyclonal anti-ChAT antibody	Millipore	AB144P
Medio de montaje ProLong Gold con DAPI	Life Technologies	P36935
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection)	Advanced Cell Diagnostics	320850	kit de hibridación in situ

Inmunotinción de neuronas en cortes de cerebro de ratón después de la hibridación fluorescente in situ

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