Imágenes de alta resolución de los receptores de neurotransmisores en las sinapsis de la retina

Resumen

Fuente: Zhang, J., et al. Análisis cuantitativo de inmunogold de alta resolución de receptores de membrana en sinapsis de cinta de retina. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra una técnica de microscopía electrónica para visualizar la localización del receptor de neurotransmisores en las sinapsis de la retina. Las secciones de la retina contienen células ganglionares de la retina que exhiben receptores de neurotransmisores unidos a la membrana y están marcadas con la subunidad B de la toxina del cólera (CTB). Al marcar los marcadores con anticuerpos conjugados con nanopartículas de oro y contrarrestar la sección con metales pesados, los receptores RGC se visualizan bajo un microscopio.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Fijación del tejido retiniano

1. Reúna los siguientes materiales y herramientas: Un microscopio de disección, 2 pinzas con puntas muy finas, tijeras, papel de filtro de celulosa, pipeta de plástico y un portaobjetos de microscopio.
2. Anestesiar a la rata en una cámara cerrada con 2,0 ml de halotano (un anestésico inhalante). Determine la anestesia adecuada por estos métodos: falta de retirada de la pata trasera después del pinzamiento del dedo del pie, o falta de reflejo de parpadeo. Luego decapitar inmediatamente con guillotina. Retire los ojos con unas tijeras de iris y colóquelos en un plato de vidrio que contenga un 4% de paraformaldehído en tampón de fosfato (PB) 0,1 M a pH 7,4.
3. Con el microscopio de disección, extirpe la córnea cortando la parte frontal del globo ocular. Retire el cristalino y el vítreo de la superficie interna de la retina con pinzas.
4. Retire la esclerótica con las dos pinzas hasta que la retina quede aislada de la copa ocular.
5. Corta la retina inmediatamente en tiras de 100 a 200 μm de grosor con una navaja y súptala a una fijación por cambio de pH.
6. Fije las tiras de retina en paraformaldehído al 4% en PB 0,1 M a pH 6,0 durante 20 - 30 min y luego en paraformaldehído al 4% más glutaraldehído al 0,01% a pH 10,5 durante 10 - 20 min a temperatura ambiente (RT).
7. Después de varios lavados en PB con 0,15 mM de CaCl₂ (pH 7,4 a 4°C), crioproteger las tiras de retina con glicerol (60 min cada una en 10%, 20%, 30%, luego durante la noche [O/N] en 30%) en 0,1 M PB antes de la sustitución por congelación.

2. Sustitución por congelación

NOTA: Este método de sustitución por congelación es una modificación de un protocolo publicado anteriormente. Además, es crucial que los instrumentos estén muy fríos (use guantes); De lo contrario, el tejido puede descongelarse parcialmente cuando se toca con los instrumentos. Todos estos pasos se realizan dentro de la cámara de sustitución automática por congelación (AFS) y nunca se permite que los instrumentos se muevan por encima del borde de la cámara. Del mismo modo, es necesario un enfriamiento adecuado de todos los productos químicos utilizados en el AFS.

1. Congele las tiras de retina en propano líquido a -184 °C en un instrumento de criopreservación (CPC) de microscopio electrónico (EM). Con un cepillo fino, coloque las muestras en pequeños trozos de cinta adhesiva doble adheridos a los trozos de metal que van en el extremo de las varillas de inmersión (absorba el tampón adicional con el cepillo).
2. Sumerja las varillas en el propano líquido y manténgalas allí durante aproximadamente 5 segundos, y luego transfiéralas al instrumento automático de sustitución de congelación (AFS) utilizando una pequeña cámara de transporte que está llena de nitrógeno líquido (LN₂ contenedor de criotransferencia enfriado).
3. Después de colocar la muestra congelada y los instrumentos (pinzas y bisturí) en el AFS, enfríe los instrumentos en la cámara durante varios minutos antes de tocar el tejido, o enfríelos colocando las puntas de los instrumentos durante unos segundos en la pequeña cámara de transporte (llena de nitrógeno líquido (LN₂ contenedor de criotransferencia enfriado)).
4. Una vez en el AFS, Retire la muestra y la cinta adhesiva del trozo con un bisturí fino. Además, mantenga abierto el control de flujo de gas nitrógeno, TF (TF se describe como un 'control regulador para el vaporizador LN₂) abierto durante estos procedimientos.
5. Antes de colocar el tejido congelado en los soportes de incrustación plana (, es decir, , antes de configurar el AFS), corte un círculo delgado de una lámina de plástico transparente y colóquelo en el fondo del soporte para revestir el fondo de cada pocillo. Esto permite una extracción relativamente más fácil de los bloques de muestras polimerizadas cuando están terminados.
   NOTA: Anteriormente, utilizamos un método alternativo a los soportes de inclusión planos, y empleamos cápsulas dobles de Reichert + gelatina.
6. Utilice la siguiente secuencia automática en el AFS (utilizando la terminología del instrumento): T1 = -90 °C durante 32 horas, S1 = aumentar la temperatura en 4 °C/h (11,3 h), T2 = -45 °C durante 50 horas, S2 = aumentar la temperatura en 5 °C/h (9 h), T3 = 0 °C durante 40 horas (total = 142,3 h). Puede llevar de 2 a 4 horas colocar las muestras en el AFS (a -90 °C) antes de comenzar la secuencia cronometrada.
7. Sumerja las secciones congeladas en acetato de uranilo al 1,5% en metanol a -90 °C durante >32 horas en el AFS. Coloque dos piezas de pañuelos (por lo general) en cada uno de los siete pocillos en el soporte de aluminio de incrustación plana (tres caben en el AFS).
   1. Coloque el tejido + cinta en el acetato de uranilo/metanol en los pocillos y retire la cinta más tarde, justo antes de comenzar la infiltración del medio de inclusión (como Lowicryl HM20), si es demasiado difícil quitar el tejido de la cinta.
8. A continuación, aumente la temperatura de forma escalonada a -45 °C (+4 °C por hora; en la secuencia automática).
9. Lave las muestras tres veces en metanol preenfriado, utilizando una pipeta de plástico de punta fina para eliminar la solución vieja de cada soporte de incrustación plana y, a continuación, utilizando otra pipeta de plástico estándar para añadir el metanol fresco preenfriado.
10. A continuación, utilizando el mismo método, infiltrar las muestras progresivamente con resinas de inclusión a baja temperatura, como el medio de inclusión (HM20/metanol a 1:1 y 2:1, cada uno durante 2 horas, seguido de resina pura durante 2 horas y luego cambiar las resinas y mantener O/N).
11. Cambia la resina de nuevo al día siguiente, ajustando el nivel de la resina para llegar justo al borde superior de los pozos.
12. Polimerizar las muestras (-45 °C a 0 °C en secuencia automática; +5 °C por hora) con luz ultravioleta (UV) durante 40 horas.
13. Luego retire las muestras del AFS. Por lo general, los bloques de muestra todavía muestran algo de color rosado. Coloque las muestras cerca de la luz fluorescente en la campana de gases químicos, a RT O/N o más tiempo hasta que parezcan completamente transparentes.

3. Postincrustación de EM Immunogold Immunocytochemistry

1. Corte secciones de 1 μm con ultramicrótomo, tiña las secciones con azul de toluidina al 1% y examínelas para determinar la orientación de la sección; Oriente el bloque de tejido para lograr el plano transversal óptimo de corte.
2. Corte secciones ultrafinas de 70 nm de espesor con ultramicrótomo y recójalas en rejillas de ranuras de níquel recubiertas de carbono Formvar.
3. Lave las rejillas una vez en H₂O seguido de una solución salina tamponada con Tris tres veces (TBS, 0,05 M tampón Tris, 0,7% NaCl, pH 7,6).
4. Incubar rejillas en 20 μl de gotas de albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en TBS durante 30 min, y luego en 20 μl de gotas de una mezcla que contenga la subunidad B de la toxina anticólera caprina (anti-CTB, 1:3.000) y un anticuerpo contra una subunidad del receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR) (subunidad NMDAR anti-glutamatérgica de conejo A [GluN2A] 1:50, GluN2B 1:30), o un receptor heterotetramérico de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico [AMPA], o un receptor de ácido anti-conejo GluA2/3 (receptor heterotetramérico de -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico [AMPA], 1:30) en TBS-Triton (TBST, 0.01% Triton X-100, pH 7.6) con 2% BSA y 0.02 M NaN₃ O/N en RT.
5. Lave las rejillas en tres gotas separadas (20 μl) de TBS (pH 7.6) durante 10, 10 y 20 min, seguidas de TBS (pH 8.2) durante 5 min.
6. Incubar las rejillas durante 2 horas en gotas (20 μl) de una mezcla que contiene inmunoglobulina G (IgG, 1:20) acoplada a partículas de oro de 10 nm e IgG anticabra de burro (1:20) acoplada a partículas de oro de 18 nm en TBST (pH 8,2) con 2% de BSA y 0,02 M de NaN₃.
7. Lave las rejillas en 20 μl gotas de TBS (pH 7,6) durante 5, 5 y 10 min, luego en agua ultrapura y luego séquelas.
8. Rejillas de contratinción con acetato de uranilo al 5% y citrato de plomo al 0,3% en H₂O durante 8 y 5 min en condiciones de oscuridad, respectivamente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Paraformaldehyde	EMS	15710
Glutarldehyde	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycerol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore AB1555P		Dilution 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	Dilution 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	Dilution 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1–046	Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm partículas	de oro EMS	25704	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm partículas	de oro EMS	25814	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm partículas de oro	EMS	25812	Dilución 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm partículas de oro	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	Dilution 1/20
Formvar-Carbon recubiertas de níquel-rejillas de ranura.	EMS	FCF2010-Ni
Acetato de uranilo	EMS	22400-1
Methanol	EMS	67-56-1
Lead citrate	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultromicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
liquid nitrogen	Roberts Oxygen
Propane	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1-1.2%
Anti-CTB	List Biological Laboratories	703	Dilution 1/4000