Monitorización en tiempo real de la activación del receptor odorante en células recombinantes

Resumen

Fuente: de March, C. A. et. al., Monitoreo in vitro en tiempo real de la activación del receptor de odorante por un odorante en la fase de vapor. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra el método para monitorear la activación en tiempo real de los receptores de odorantes en células recombinantes de mamíferos utilizando la medición de luminiscencia. La unión de odorantes desencadena la activación de la proteína G y la producción de AMPc, activando las proteínas glosensoras que emiten luminiscencia al unirse al sustrato, proporcionando una medida cuantitativa de la respuesta del receptor.

Protocolo

1. Hana3A Cells Culture

1. Prepare M10 (Medio Esencial Mínimo (MEM) más 10 % v/v suero fetal bovino (FBS)) y M10PSF (M10 más 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina y 1,25 μg/mL de anfotericina B).
2. Cultiva las células en 10 mL de M10PSF en una placa de cultivo celular de 100 mm en una incubadora configurada a 37 °C y 5% de dióxido de carbono (CO2).
3. Divida las células cada 2 días en una proporción del 20%: cuando se observe una confluencia del 100% de las células (aproximadamente 1,1 x 10⁷ células) bajo un microscopio de contraste de fase, aspire el medio y lave las células suavemente con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
4. Aspire PBS y agregue 3 mL de ácido tetraacético tripsina-etileno diamina al 0,05% (EDTA, 0,48 mM). Dejar actuar durante 1 minuto aproximadamente, hasta que las células se disocien de la placa.
5. Añade 5 mL de M10 para inactivar la tripsina y finalmente separar las células aún adheridas a la placa pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
6. Transfiera el volumen (8 mL) a un tubo de 15 mL y centrifugue a 200 x g durante 5 min. Aspire el sobrenadante y resuspenda las células en 5 mL de M10PSF pipeteando hacia arriba y hacia abajo para romper cualquier masa celular. Evite crear burbujas en el tubo.
7. Transfiera 1 mL de la solución de células resuspendidas en una nueva placa de cultivo celular de 100 mm y agregue 9 mL de M10PSF fresca. Incubar a 37 °C y 5% de_CO2.

2. Preparación de las células para la transfección

1. Evalúe la confluencia, o el número de células, observándolas bajo un microscopio de contraste de fase. Se necesita al menos un 10% de confluencia (aproximadamente 1,1 x 10⁶ celdas) para una placa.
2. Aspire el medio y lave las células suavemente con 10 mL de PBS. Aspire PBS y agregue 3 mL de EDTA. Dejar actuar durante aproximadamente 1 min a temperatura ambiente, hasta que las células se disocien de la placa.
3. Añade 5 mL de M10 para inactivar la tripsina y finalmente separa las células aún adheridas a la placa pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera el volumen (8 mL) a un tubo de 15 mL y centrifugue a 200 x g durante 5 min.
4. Aspira el sobrenadante y resuspende las células en 5 mL de M10PSF pipeteando hacia arriba y hacia abajo para romper cualquier masa celular. Evite crear burbujas en el tubo.
5. Dependiendo del número de placas a transfectar, transfiera una cantidad adecuada de células en un depósito con el volumen correspondiente adecuado de M10PSF. Una placa de 96 pocillos debe cubrirse con 1/10 de una placa de 100 mm 100% confluente (aproximadamente 1,1 x 10⁶ células) diluida en M10PSF para alcanzar un volumen total de 6 mL. Para una placa de 96 pocillos que comienza con una placa de 100 mm con una confluencia del 100%, agregue 500 μL de los 5 mL de células resuspendidas a 5,5 mL de M10PSF fresco. Mezclar las celdas y M10PSF sin generar burbujas de aire.
6. Pipetea 50 μL de las células suspendidas en cada pocillo de la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Incubar durante la noche a 37 °C y 5 % de_CO2.

3. Plasmid Transfection

1. Observe la placa de 96 pocillos bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar una confluencia celular entre el 30% y el 50%.
2. Prepare una primera mezcla de transfección que contenga los plásmidos comunes a toda la placa (una versión más corta de la proteína transportadora de receptores 1 (RTP1S), el receptor odorante (OR) y la proteína Glosensor; ver Tabla de Materiales) siguiendo los volúmenes de la Tabla 1. Tenga en cuenta que la cantidad de OR marcado con Rho debe dividirse por el número de OR si hay varios OR.
   NOTA: Recomendamos encarecidamente añadir un control negativo vectorial vacío (aquí Rho-pCI) y cualquier control positivo (O que se sepa que responde al odorante probado) al plan del experimento.
3. Prepare una segunda mezcla de transfección que contenga 500 μL de MEM y 20 μL de reactivo Lipofectamine 2000 (válido para una placa de 96 pocillos, ver Tabla de Materiales). Agregue la segunda mezcla a la primera y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Agregue 5 mL de M10 y mezcle suavemente.
4. Reemplace el M10PSF en la placa de 96 pocillos previamente plateada por 50 μL del medio de transfección final. Incubar en una incubadora ajustada a 37 °C y 5% de CO₂ y aspirar la cámara del luminómetro durante la noche.

4. Incubación

1. de sustratosObserve la placa de 96 pocillos bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar una confluencia celular entre el 60% y el 100%. Prepare una solución de simulación de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene 10 mM de ácido hidroxietilpiperazinaetanosulfónico (HEPES) y 5 mM de D-glucosa.
2. Diluye 75 μL de la solución del reactivo de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) (ver Tabla de Materiales) a 2,75 mL de la solución de estimulación. Retire el medio de transfección de la placa de 96 pocillos y lave las células añadiendo 50 μL de solución de estimulación fresca a cada pocillo.
3. Retire la solución de estimulación y agregue 25 μL de solución de reactivo de AMPc preparada en el paso 4.2 a cada pocillo. Incube la placa de 96 pocillos a temperatura ambiente en un ambiente oscuro y libre de olores (por ejemplo, un cajón limpio y vacío lejos de productos químicos o cualquier fuente de olor) durante 2 h.

5. Odorant Stimulation

1. Primero, equilibra la cámara del luminómetro con moléculas odorantes volátiles. Diluir el odorante hasta la concentración deseada en 10 mL de aceite mineral (Figura 1A). Antes de que finalice el tiempo de incubación del reactivo de AMPc, agregue 25 μL de la solución odorante a una nueva placa de 96 pocillos (no la que contiene las celdas). Incube esta placa odorante a temperatura ambiente en la cámara del luminómetro durante 5 minutos (Figura 1B) (aquí no se requiere registro del luminómetro).
2. Configura el luminómetro para registrar la luminiscencia con 0 s de retardo durante 20 ciclos de medición de placas de 90 s con 0.7 s de intervalo entre ciclos.
3. Justo antes de leer la placa, retire la placa odorante de la cámara. Agregue 25 μL de odorante entre los pocillos de la placa de 96 pocillos que contiene las celdas (no agregue el odorante en los pocillos que contienen las celdas) e inicie rápidamente la medición de luminiscencia de todos los pocillos durante 20 ciclos dentro de 30 min (Figura 1C).

Tabla 1: Mezcla para la transfección. Cantidades de plásmidos (proteína Glosensor, RTP1S y OR) para agregar a MEM para transfectar a una placa de 96 pocillos.

	Por placa de 96 pocillos
MEM	500 μL
pGlosensor	10 ng
RTP1S	5 ng
OR	75 ng

 

Resultados

Figura 1: Protocolos esquemáticos para el monitoreo en tiempo real de la activación del receptor de odorante por odorante vaporizado. El odorante (violeta) se diluyó a la concentr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Tripsina - EDTA (1x), rojo fenol - almacenar a 4 °C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm tubos
96-well plate	Corning	3843	96 pozo, con tapa LE blanca con fondo transparente Poly-D-lysine recubierto de poliestireno
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 μg/mL - almacenar a 4 °C
Centrifuge machine	Jouan	C312	Máquina centrífuga con rotor de cangilón oscilante para 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	Fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Suero fetal bovino - almacenar a -20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reactivo sustrato de proteína luminiscente - almacenar a -20 °C
Incubadora 37 °C; 5 % dióxido de carbono	Fisher Scientific	11-676-604	Incubadora para el cultivo de células
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reactivo 1mg/ml reactivo de transfección - almacenar a 4 ° C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 lector de placas de pocillos para luminiscencia
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvente para odorantes - almacenar a temperatura ambiente
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle's salts & L-glutamine - almacenar a 4 °C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333<
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F plásmido de proteína luminiscente cAMP - almacenar a 4 °C
Phase contrast microscope	Leica	090-131.001	Microscopio de contraste de fase con objetivos x4, x10, x20
RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 ng/μL plásmido -

cónicostd style='background-color:#ffffff; relleno: 0px 3px; vertical-align:top;' >Solución de penicilina-estreptomicina estabilizada con 10.000 U de penicilina y 10 mg de estreptomicina - almacenar a -20 °C almacenar a 4°C