Inducir la formación de coágulos de sangre en el cerebro del ratón utilizando un tinte fotosensible

Resumen

Fuente: Talley Watts, L., et al. Fototrombosis de Bengala Rosa por imágenes ópticas confocales in vivo: un modelo de accidente cerebrovascular de un solo vaso. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra una técnica para inducir la formación de coágulos de sangre en el cerebro de un ratón. Un ratón anestesiado con una ventana craneal y un cráneo adelgazado sufre fototrombosis a través de la activación de un tinte fotosensible utilizando luz de alta intensidad. Este proceso genera especies reactivas de oxígeno, que dañan las paredes de los vasos y desencadenan la formación de coágulos, lo que en última instancia obstruye el flujo sanguíneo al cerebro.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Anestesia para la Preparación Cortical

1. Coloque al ratón en una cámara de inducción con 2-3% de isofluorano mezclado con oxígeno para inducir la anestesia. Observe que la tasa respiratoria disminuye a medida que el ratón es inducido. Pellizque la pata del ratón para determinar si el ratón está listo para moverse hacia el cono de la nariz. Nota: El nivel de anestesia es un paso crítico en cualquier preparación in vivo y se debe tener cuidado de no inducir un nivel que cause isquemia global.
2. Una vez que el ratón esté suficientemente anestesiado, transfiera al animal a la plataforma de cirugía/imagen y coloque la nariz del ratón en el cono de la nariz y aplique 1-1.2% de isofluorano para mantener un estado anestesiado. Asegúrese de que el mouse esté colocado sobre una almohadilla térmica con temperatura controlada para mantener la temperatura corporal (37 °C +/- 0,5 °C) durante los procedimientos restantes. Coloque ungüento veterinario sobre los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
3. Monitorea la fisiología del ratón usando un sistema de oximetría de pulso usando la pinza de cola o pie provista con el sistema. Comprobar que la frecuencia respiratoria se mantiene entre 50-65 respiraciones/min. Comprobar que la frecuencia cardíaca se mantenga entre 300 a 450 lpm y que la saturación de oxígeno se mantenga entre el 97-98% para asegurar la supervivencia a largo plazo del animal.
4. Cuando el ratón esté adecuadamente anestesiado, afeitar el vello sobre el cráneo con una maquinilla eléctrica, eliminar el vello residual y limpiar con betadine, seguido de un hisopo de etanol. Repita este procedimiento hasta tres veces para garantizar un entorno quirúrgico estéril.

2. Surgical Procedure

1. Con el cuero cabelludo completamente limpio y afeitado, haga una incisión de 5 mm en el cuero cabelludo del ratón para revelar las fisuras craneales y localizar bregma.
2. Utilice un aplicador de algodón estéril para eliminar cualquier fascia restante que cubra el cráneo.
3. Pega un anillo de acero inoxidable hecho a medida (Figura 1) con adhesivo tisular al hueso que recubre la corteza parietal utilizando las coordenadas estereotáxicas de Bregma: -1 a -3 mm y lateral: 2-4 mm. Nota: El pegamento generalmente se fija dentro de los 2 minutos posteriores a la colocación del anillo en el hueso.
4. Fije el anillo a un soporte estereotáxico (Figura 2) para estabilizar el ratón y evitar el movimiento durante la toma de imágenes.
5. Bajo un microscopio de disección de grado quirúrgico, taladre lentamente una sección de 1-2 mm en el cráneo utilizando una herramienta tipo Dremel de velocidad controlada (broca Meisinger de 3.9 mm) asegurándose de mantener el área nivelada a medida que se perfora. Logre esto usando un patrón en zig-zag. Para evitar la acumulación de calor, ajuste la velocidad de perforación a baja y tome descansos frecuentes.
6. Cuando el cráneo craneal se vuelve brillante en apariencia, continúe el adelgazamiento del cráneo usando una hoja de bisturí utilizando el mismo patrón en zig-zag para mantener la superficie adelgazada nivelada para facilitar la eliminación suave de las capas delgadas del cráneo craneal. Con la punta de la hoja del bisturí, haga pequeños trazos lineales con una ligera presión para eliminar capas delgadas de hueso a la vez. Continúe hasta que la vasculatura sea claramente visible a través del microscopio de disección.
7. Si el experimentador perfora o rompe el cráneo durante el proceso de adelgazamiento, eutanasia al animal debido a un probable daño en la corteza subyacente.
   Nota: El cráneo del ratón tiene aproximadamente 300 μm de grosor y está compuesto por dos capas delgadas de hueso compacto (una capa externa y otra interna) y una capa de hueso esponjoso intercalada entre las dos capas de hueso compacto. La capa externa de hueso compacto y la mayor parte del hueso esponjoso se eliminan dentro del área de perforación de 5 mm, lo que da como resultado una capa de hueso compacto de aproximadamente 50 μm (ver Figura 2B). La visualización de la vasculatura asegurará que el cráneo adelgazado intacto final tenga aproximadamente 50 μm de grosor. Por lo tanto, el cráneo todavía está presente cuando se adelgaza a este grosor.

3. Microscope Set-up

1. Utilice un sistema de microscopio invertido (convencional, confocal o sistemas de dos fotones) que tenga un inversor de objetivo. Nota: También es posible utilizar un microscopio vertical estándar. El factor limitante será el espacio entre la etapa y los objetivos. Es posible que sea necesario realizar modificaciones en el escenario para lograr esta configuración.
2. Asegure la plataforma quirúrgica/de imagen a una platina hecha a medida que se encuentra a un lado de la base del microscopio. Nota: La plataforma se fabrica utilizando un gato de laboratorio para permitir el movimiento vertical de la plataforma quirúrgica/de imagen debajo del objetivo. El gato de laboratorio está montado en una placa fijada a cuatro polos cilíndricos. (Ver Figura 2).
3. Coloca el inversor de objetivo que contiene un objetivo 20X sobre la ventana craneal. Utilice una fuente de luz externa para encontrar la ventana craneal mirando a través de los oculares del microscopio y coloque el objetivo en el área de la imagen. Nota: El área de la imagen se denotará por la presencia de la vasculatura.
4. Para objetivos a base de agua, utilice líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) (130 mM de NaCl; 30 mM de KCl; 12 mM de KH₂PO₄; 200 mM de NaHCO₃; 30 mM de hidroxietilpiperazina, etano sulfónico de ácido [HEPES]; y 100 mM de glucosa) como medio debido a la posible fuga en la cavidad craneal durante la obtención de imágenes (Figura 3).

4. Preparación del tinte de Rosa Bengala, Administración e Inducción de Trazos

1. Prepare una solución fresca de 20 mg/ml de Rosa de Bengala en un CSF; filtre y esterilice antes de la administración. No reutilice ni almacene la Rosa de Bengala una vez que se haya mezclado. Haz una nueva solución para cada experimento.
2. Administre una inyección de 0.1 ml en la vena de la cola de Rose Bengal mientras escanea la ventana craneal con un láser de 561 nm para asegurar una inyección adecuada de la solución. Nota: La rosa de Bengala se visualizará dentro de los 5 segundos posteriores a la inyección en la vasculatura del cerebro. Todo el recipiente debe estar lleno de Rosa de Bengala.
3. Después de una inyección adecuada de colorante de Rosa de Bengala, elija un recipiente apropiado para la trombosis en función del diámetro del vaso (40-80 μm) para garantizar la reproducibilidad de un volumen de lesión particular. Diferencie entre arterias y venas observando la dirección del flujo sanguíneo: las arterias se moverán de vasos de mayor diámetro a vasos de menor diámetro, las venas se moverán de vasos de menor a mayor diámetro. Esto se logra fácilmente mediante la visualización una vez que se inyecta Rose Bengal.
4. Cambia la configuración del microscopio de la siguiente manera:
   1. Aumenta el tiempo de permanencia. Nota: Esto variará dependiendo del sistema de microscopio que se utilice.
   2. Aumenta la potencia del láser al 100%.
   3. Recopila imágenes de secuencia de tiempo a 1 fotograma/seg utilizando la velocidad máxima de escaneo.
5. Escanea el ratón hasta que se forme un coágulo estable dentro del recipiente. Nota: Por lo general, esto se logra dentro de los 5 minutos posteriores a la exploración continua (consulte la Figura 4).
6. Después de la inducción de la formación de coágulos utilizando Rose Bengal, retire el ratón del área de imagen y devuelva al microscopio de disección. Retire con cuidado el anillo de acero inoxidable del cráneo craneal. Examina la ventana craneal en busca de sangrado. Si se produce sangrado, finalice el experimento.
7. Utilice la sutura de monofilamento 6.0 para cerrar la incisión sobre el cráneo. Coloque un ungüento antibiótico a lo largo de la línea de sutura para prevenir la infección. Inyecte Buprenex (0,05 mg/kg) por vía subcutánea cada 12 horas durante tres días para el tratamiento del dolor.
8. Devuelve el ratón a una cámara de recuperación después de retirarlo del anestésico hasta que esté completamente despierto y se mueva libremente.
9. Devuelve el ratón a una jaula limpia para una investigación más profunda en un momento posterior.

Resultados

Figura 1: Anillo de acero inoxidable. Se muestran tres vistas (vista superior, lateral e inferior) del soporte de anillo de acero inoxidable que se aplica al cráneo del ratón para fijarlo al soporte estereotáxico.

Materiales