Modelado de la regeneración sensorial de axones en una rata mediante la inyección de ganglios de la raíz dorsal y la lesión por aplastamiento de la raíz dorsal

Resumen

Fuente: Cheah, M., et al. Inyección de ganglios de la raíz dorsal y lesión por aplastamiento de la raíz dorsal como modelo para la regeneración sensorial de axones. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra un procedimiento paso a paso para inyectar una suspensión viral en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) e inducir una lesión axonal controlada a través de un aplastamiento de la raíz dorsal en una rata anestesiada. El protocolo implica exponer los DRG, administrar un vector viral promotor del crecimiento para facilitar la regeneración axonal y cortar las conexiones axonales con la médula espinal para modelar la lesión y regeneración de los nervios sensoriales.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Inyectando DRG y realizando una lesión por aplastamiento de la raíz dorsal

NOTA: Esta es una cirugía extremadamente delicada. Es aconsejable practicar primero con algunos animales muertos para familiarizarse con la anatomía antes de pasar a la cirugía de animales vivos.

1. Localiza las prominentes apófisis espinosas C2 y T2 sobre la piel. Haga una incisión en la piel entre las apófisis espinosas C2 y T2 con una hoja de bisturí n.º 10 (una vez que se abre la piel, debe verse una línea media blanca de tejido fibroso en la primera capa de músculo; la primera capa de músculo tiene una textura "gelatinosa").
2. Haz una incisión de tamaño similar en la primera capa de músculo a lo largo de la línea media blanca con una hoja de bisturí. No vaya más allá de la prominente apófisis espinosa T2, ya que hay una rama arterial principal de la aorta descendente ubicada cerca de allí.
   NOTA: El sangrado abundante puede ocurrir en cualquier lugar a partir de este paso. Detenga siempre el sangrado y extraiga la sangre utilizando bastoncillos de algodón esterilizados o esponjas quirúrgicas absorbibles para permitir una visualización clara en todo momento. Continuar con el procedimiento "a ciegas" puede resultar en daños no deseados en la médula espinal, DRG o raíz dorsal, lo que lleva a efectos adversos inesperados en el animal más adelante.
3. Retrae la primera capa de músculo usando dos retractores, uno colocado rostralmente y otro caudalmente; la segunda capa de músculo, con una apariencia estriada, debe ser visible.
4. Localiza la línea media de la segunda capa de músculo (donde se pueden observar dos músculos longitudinales conectados por un tejido delgado y membranoso). Disecciona el tejido membranoso con unas microtijeras para separar los dos músculos longitudinales. Evite usar una hoja de bisturí si es posible, ya que esto puede provocar daños musculares y sangrado innecesarios.
5. Ajusta los retractores en consecuencia para exponer la tercera capa de músculo delgado que cubre la columna vertebral. Las apófisis espinosas se pueden sentir tocando ligeramente con un par de pinzas sobre la tercera capa de músculo.
6. Haga una pequeña incisión en la tercera capa del músculo con microtijeras y raspe suavemente el músculo del hueso con una cureta o bisturí de manera lateral para exponer claramente las vértebras. Si es necesario, corte parte del músculo o tendón para facilitar la laminectomía.
7. Para exponer los DRG C5 - C8 izquierdos, realice una hemilaminectomía izquierda en las vértebras C4 - T1 retirando cuidadosamente parte de la lámina y el pedículo con un par de rongeurs finos. El DRG se encuentra cerca del foramen transversal de las vértebras.
   NOTA: Las vértebras C3 - C7 no tienen un proceso espinoso prominente. El DRG C5 se encuentra entre las vértebras C4 y C5, el DRG C6 está entre las vértebras C5 y C6, y así sucesivamente, mientras que el DRG C8 está entre las vértebras C7 y T1. No hay vértebra C8, a pesar de la presencia de un DRG C8 y un segmento de la médula espinal C8.
8. Una vez que se haya expuesto suficiente DRG para la inyección, prepare la jeringa colocando la jeringa de microlitro llena de virus equipada con una aguja roma de calibre 33 hecha a medida en el soporte de la jeringa estereotáxica. Antes de la inyección, use una aguja biselada de calibre 30 para hacer una pequeña abertura superficial en cada uno de los DRG objetivo para ayudar con la inserción de la aguja de inyección.
9. Inserta la aguja de calibre 33 en el centro del DRG girando suavemente las perillas para ajustar las coordenadas estereotáxicas. No inserte demasiado la aguja, ya que esto puede hacer que el líquido se escape del lado ventral del DRG. En caso de fuga, ajuste la posición de la aguja inmediatamente.
   NOTA: Las coordenadas estereotáxicas numéricas no se utilizan; sin embargo, es útil utilizar el marco para sostener la aguja para la inyección.
10. Inyecte 1 μL del virus en cada DRG a 0.2 μL/min utilizando una bomba de jeringa de infusión. Espere tres minutos más antes de retirar la aguja. Durante la inyección, el DRG cambiará lentamente de color si la solución del virus contiene un tinte coloreado.
11. Para realizar una lesión concurrente por aplastamiento de la raíz dorsal C5 - C8, triture cada raíz tres veces durante 10 s cada una utilizando un par de pinzas de punta fina (Bonn Micro), oponiéndose completamente a los extremos de las pinzas; debe aparecer una línea blanca en el tejido en el sitio de la trituración. No profundice más de lo requerido con las pinzas, ya que esto puede causar daños en la raíz ventral.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fast Green FCF dye	Sigma-Aldrich	F7258	Para visualizar una solución incolora. Concentración recomendada: 1%
Olsen-Hegar Needle Holder	Fine Science Tools	FST 12502-12
Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup	Fine Science Tools	FST 16121-14
Bonn Micro Gripps	Fine Science Tools	FST 11083-07	For performing dorsal root crush injury
Tijeras separadoras de tejidos	Fine Science Tools	FST 14072-10
Fine Scissors	Fine Science Tools	FST 14058-11
Micro-Adson Gripps	Fine Science Tools	FST 11018-12
Goldstein Retractor	Fine Science Tools	FST 17003-03
Vannas Spring Scissors (recta)	Fine Science Tools	FST 15018-10
SURGIFOAM Esponja de gelatina absorbible	Ethicon	1972	For bleeding control
Microliter Syringe RN701 (10 μl)	Hamilton	80330
Aguja removible hecha a medida (para inyección DRG)	Hamilton	7803-05	33 gauge, 38 mm, point style 3
UltraMicroPump con controlador SYS-Micro4	World Precision Instruments	UMP3-1