Evaluación de la integridad de la barrera hematoencefálica en un modelo de rata con lesiones cerebrales inducidas por láser

Resumen

Fuente: Kuts, R. et al. Lesión cerebral inducida por láser en la corteza motora de ratas. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la evaluación de la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) después de una lesión cerebral inducida por láser en ratas. Se inyecta un tinte de rastreo en la vena de la cola, lo que permite que circule al cerebro y se filtre en el tejido a través de la BHE dañada. A continuación, se extrae el cerebro y se procesa para liberar el tinte. La intensidad de fluorescencia del tinte se mide para cuantificar el alcance del daño BBB inducido por el láser.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Procedimiento

1. experimental de lesión cerebral inducida por láserAsigne 20 ratas a un grupo marcado como grupo láser y 20 ratas a otro grupo de control (operado simuladamente).
2. Somete las ratas del grupo láser a la irradiación láser a 50J X 10 puntos de la siguiente manera:
   1. Anestesia a la rata con una mezcla de 2% de isoflurano en oxígeno permitiendo la ventilación espontánea. Compruebe si hay suficiente profundidad anestésica pellizcando la cola con pinzas para ver la ausencia del reflejo de retirada.
   2. Mantenga la temperatura corporal central de la rata a 37 °C durante todo el procedimiento experimental utilizando una almohadilla térmica regulada por temperatura rectal.
   3. Elimina el vello local con una afeitadora y desinfecta con 70% de alcohol y 0.5% de gluconato de clorhexidina. Repita el paso de desinfección dos veces más.
      NOTA: El tamaño de la incisión quirúrgica debe ser de aproximadamente 3 cm. Retire el vello al menos 2 cm alrededor del área de la incisión.
   4. Coloque la rata en un soporte de cabeza estereotáxico en posición prona y haga una incisión de 3 cm para reflejar el cuero cabelludo lateralmente y exponer el área entre Bregma y Lambda.
   5. Mantener la anestesia a través del cono de la nariz.
   6. Utilice láser de granate de itrio y aluminio dopado con neodimio (Nd-YAG) (longitud de onda máxima 1064 nm) para administrar 50J X 10 puntos, con una duración de pulso de 1 s, en el área expuesta del cráneo por encima del hemisferio derecho.
   7. Asegúrese de que la parte generadora de láser del aparato esté a una distancia de 2 mm del área expuesta para producir un rayo láser. Se seleccionaron 50puntos J X 10 después de una evaluación cuidadosa de diferentes combinaciones de energía/superficie. Esta combinación es eficiente y no causa destrucción ósea del cráneo después de la administración durante menos de un segundo.
      NOTA: 2 mm es la distancia entre el terminal del rayo láser (desde el cable óptico por el que pasa) y el hueso del cráneo. En caso de que se utilice una lente de enfoque, la distancia debe calcularse teniendo en cuenta el ángulo de inclinación de la lente para enfocar el haz en el área deseada de daño. Garantice la seguridad adecuada al usar un dispositivo láser, incluida la capacitación y la protección ocular adecuadas.
   8. Retire la rata del dispositivo y cierre el cuero cabelludo con suturas quirúrgicas de seda 3-0.
   9. Suspende la anestesia y devuelve la rata a su jaula para su recuperación. Administrar 0,1 mL de bupivacaína al 0,25% localmente para reducir el dolor postoperatorio inmediatamente después de la cirugía.
      NOTA: Todo el procedimiento debería durar menos de 5 minutos si se realiza correctamente.
3. Observe a la rata para detectar cualquier signo de angustia durante la recuperación postanestésica. Antes de salir de la anestesia, administrar 0,01 mg/kg de buprenorfina intramuscular para la analgesia postoperatoria y continuar con dosis repetidas cada 12 h durante al menos 48 h.
4. Somete a las ratas de control a las mismas condiciones sin someterlas al láser.

2. Puntuación de gravedad neurológica (NSS)

1. Evalúe la puntuación de gravedad neurológica 24 h después de la lesión cerebral inducida por láser utilizando una puntuación de 43 puntos. Evalúe a los animales para detectar déficits neurológicos, alteraciones del comportamiento, tareas de equilibrio de haces y reflejos, asignando puntuaciones más altas para discapacidades más graves.

3. Evaluación de la lesión

1. cerebralDeterminación del alcance de la rotura de la barrera hematoencefálica (BBB)
   NOTA: Evalúe la rotura de la BBB 24 h después de la lesión cerebral inducida por láser de la siguiente manera:
   1. Administre el 2% de Evans Blue mezclado con 4 mL/kg de solución salina por vía intravenosa a las ratas a través de la vena de la cola canulada y deje que la solución circule durante 1 h.
   2. Eutanasiar ratas exponiéndolas a un 20% de oxígeno y un 80% de CO₂ (a través de la inspiración) 24 h después de la última NSS.
   3. Cosecha el tinte localizado intravascularmente de la siguiente manera:
      1. Abre los pechos de las ratas con pinzas quirúrgicas y tijeras quirúrgicas.
      2. Perfundir a los animales con solución salina enfriada al 0,9% a través del ventrículo izquierdo utilizando 110 mmHg hasta obtener un líquido de perfusión incoloro de la aurícula derecha.
   4. Cosecha los sesos y córtalos rostro-caudalmente en rodajas de 2 mm.
   5. Separe las porciones del cerebro izquierdo de las partes derechas para evaluar los hemisferios lesionados y no lesionados por separado.
   6. Pesa, homogeneiza con mortero y luego incuba los tejidos cerebrales en ácido tricloroacético al 50% durante 24 h.
   7. Centrifugar las rebanadas de cerebro homogeneizadas a 10,000 × g durante 20 min.
   8. Mezcle 1 mL del sobrenadante del cerebro centrifugado con 1.5 mL de etanol al 96% a 1:3 y evalúe la ruptura de la barrera hematoencefálica utilizando un detector de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 620 nm (ancho de banda de 10 nm) y una longitud de onda de emisión de 680 nm (ancho de banda de 10 nm).
      NOTA: Ambos grupos de ratas se someten al mismo protocolo para determinar la descomposición de BBB.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
50% ácido tricloroacético	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Brain & Tissue Matrices	SIGMA - ALDRICH	15013
Cánula Venflon 22 G	KD-FIX	1.84E+11
Centrífuga Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Balanzas analíticas compactas	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Báscula digital	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Tijeras de disección	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Pipeta Eppendorf	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tube	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
Ethanol 96 %	ROMICAL		Líquido Inflamable
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Detector de fluorescencia	Tecan, Männedorf Suiza	modelo Infinite
Calentador con termómetro	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Manguito de infusión	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40 microscopio	Olympus
Petri plateas	SIGMA - ALDRICH	P5606
Cuchillas de bisturí 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (granate de itrio y aluminio dopado con neodimio) máquina láser	Laser Industries Ltd
Soporte de cabeza estereotáxico	KOPF	900LS
Jeringa estéril 2 ml	Braun	4606027V
Aguja de jeringa 27 G	Braun	305620

200 PRO lector multimodo