Localización de fluorescencia de proteínas de unión estrecha y fibras de estrés en células endoteliales

Resumen

Fuente: Alluri, H., et al. Privación y reoxigenación de oxígeno-glucosa como modelo de lesión in vitro por isquemia-reperfusión para el estudio de la disfunción de la barrera hematoencefálica. J. Vis. Exp. (2015).

El video demuestra la localización fluorescente de proteínas de unión estrecha y fibras de estrés en células endoteliales microvasculares del cerebro de rata (RBMEC). En la monocapa sometida a estrés, se utilizan anticuerpos marcados con fluorescencia para marcar las proteínas de unión estrecha, mientras que la faloidina marcada con fluoróforos marca las fibras de estrés. A continuación, las moléculas marcadas se visualizan a través de la microscopía confocal.

Protocolo

1. Siembra de células endoteliales

1. Obtener cultivos primarios de RBMECs de ratas Sprague Dawley adultas (u obtenerlos comercialmente).
2. Cultive RBMEC en placas de Petri recubiertas de fibronectina de 100 cm (50 μg/ml) utilizando el medio de crecimiento de células endoteliales del cerebro de rata. Cambie el medio cada dos días, hasta alcanzar la confluencia.
3. Al alcanzar el 80-90% de confluencia, lavar suavemente las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante remolino. A continuación, las células se separan exponiéndolas a 1 ml de solución tibia de tripsina-etilendiaacético (EDTA) al 0,25%, equilibrada a 37 °C.
4. Incubar las células a 37 °C durante 2-5 min hasta que las células se desprendan y se dispersen.
   NOTA: Golpee la placa de cultivo para separar las células. Observe las células bajo el microscopio para confirmar el desprendimiento completo de las células de la superficie de la placa.
5. Agregue 5 ml de medio completo a la placa de Petri para neutralizar la tripsina. Pipetear el medio que contiene células desprendidas y recogerlo en un tubo de centrífuga de 15 ml.
6. Centrifugar el medio que contiene células endoteliales a 220 x g durante 5 min.
7. Aspire el sobrenadante y conserve las células que contienen gránulos. Suspenda el gránulo en 3-5 ml de medio de crecimiento de células endoteliales frescas de cerebro de rata mezclándolo suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta. A continuación, se contarán las células mediante un contador de células automatizado o un hemocitómetro.
8. Transfiera la suspensión celular a un sistema de portaobjetos de 8 pocillos prerrecubierto de fibronectina (50 μg/ml), 0,7 cm²/pocillo con una densidad de siembra que oscila entre 10.000 y 15.000 células por pocillo. Cultive las células a 37 °C hasta que se logre la confluencia
   NOTA: Para realizar Western blots u otros experimentos, las células se pueden cultivar en placas de cultivo celular de 10 cm o en placas especiales según lo requiera el experimento.

2. Privación-Reoxigenación de Oxígeno y Glucosa (OGD-R) In Vitro Model

1. Utilice el sistema de cultivo celular de hipoxia para estudiar los efectos de OGD-R en RBMEC en (ver Figura 1{{TAG_ 111}}). Configure y calibre el sistema de cultivo celular de hipoxia antes de comenzar el experimento, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Retire los portaobjetos de la cámara confluente (paso 1.8) de la incubadora a 37 °C. Sustituya el medio completo en el portaobjetos de la cámara con medio de águila modificado (DMEM) desoxigenado, sin glucosa, y se coloque en la cámara de hipoxia con un 95%, N₂ y 5% de CO₂ durante 2 h a 37 °C, para representar la condición OGD.
3. Traslade las células de vuelta a la incubadora con un 95% de O₂, 5% de CO₂ a 37 °C y se les proporciona un medio completo de células endoteliales frescas de cerebro de rata e incubar durante 1 hora más a 37 °C.
   {{TAG_ 154}}NOTA: Este paso representa una situación de reoxigenación.
4. Utilice los portaobjetos de la cámara para la localización de la inmunofluorescencia y el marcaje de la rodamina faloidina (ver sección 3).

3. Inmunofluorescencia: Localización de zonula occludens-1 (ZO-1) y actina filamentosa ({{}}f-actina) Etiquetado con faloidina de rodamina

1. Exponer los portaobjetos de la cámara que contienen monocapas RBMEC hasta 100 μl de opti-MEM/medio sérico reducido/pocillo durante 1 hora. Lave los portaobjetos de la cámara 3 veces en 100 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,0-7,2).
2. Fijar las celdas con 100 μl de paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,0-7,2) durante 15 min y lavar los portaobjetos de la cámara 3 veces más en PBS (pH 7,0-7,2).
3. Permeabilizar las células utilizando 100 μl de Triton X-100 al 0,5% en PBS, (pH 7,0-7,2) durante otros 15 min. Bloquear con 100 μl de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% en PBS durante una hora. Después de este paso, tiña/marque las células para ZO-1 o f-actina.
   1. Para la tinción con inmunofluorescencia, incubar las células con un anticuerpo primario anti-conejo contra ZO-1 en 1:150, preparado en BSA-PBS al 2% durante la noche (O/N) a 4 °C. Lavar las células 3 veces en PBS (pH 7,0-7,2). Incubar con 100 μl de anticuerpo secundario anti-conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT).
   2. Para el marcaje de rodamina y faloidina, después del bloqueo, exponga las células a 100 μl de rodamina faloidina en dilución 1:50, preparada en BSA-PBS al 2%, durante 20 min.
   3. Lave las células de la tinción de inmunofluorescencia y el marcaje de rodamina faloidina en PBS, (pH 7.0-7.2). Monte las cámaras utilizando medios de montaje que contengan un reactivo antidecoloración con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
4. Visualice las células utilizando una lente de inmersión en agua de 60X y las células se escanean en un solo plano óptico bajo un microscopio confocal.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, sin glucosa	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 pozos estériles, portaobjetos de vidrio	Thermo scientific	177402
FITC-tagged anti-rabbit secundario anticuerpo	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Se puede utilizar cualquier otro PBS disponible