Un modelo de lesión mínima de la médula espinal para estudiar la activación y migración de las células madre neurales

Resumen

Fuente: Lakshman, N., et al. Un ensayo de neurosfera para evaluar la activación de células madre neurales endógenas en un modelo de ratón de lesión mínima de la médula espinal. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra la activación y migración de células madre neurales (NSC) en un modelo de lesión de la médula espinal en ratones. Para exponer la médula espinal, se extrae una vértebra de la región torácica de la columna vertebral de un ratón anestesiado. A continuación, se crea una lesión superficial en la sustancia blanca de la médula espinal mediante una aguja doblada, que preserva el canal central. Después de la lesión, las NSC que rodean el canal se activan y migran al sitio de la lesión para ayudar a la reparación del tejido.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Cirugía de Lesión Mínima de la Médula Espinal

NOTA: Antes de la cirugía, asegúrese de que todos los instrumentos y materiales quirúrgicos estén esterilizados con métodos apropiados (Figura 1A).

1. Construya un arco de soporte torácico enrollando 4-5 cuadrados de gasa y pegándolos con cinta adhesiva en el medio para obtener un rollo fijo de gasa.
2. Coloque el ratón en la cámara de inducción e inicie la anestesia con isoflurano al 5%. Confirme la ausencia de un reflejo de pellizco del dedo del pie antes de continuar, así como durante todo el procedimiento. Dado que la cirugía puede tardar más de 30 minutos en completarse, optimice la exposición mínima al isoflurano (5 minutos al 5% y el tiempo restante al 2-3%).
3. Transfiera el ratón a un cono de nariz conectado a la máquina de anestesia con una dosis de mantenimiento de isoflurano del 2-3%. Use cortapelos para quitar el pelo del dorso del animal desde la mitad de la espalda hasta el cuello / orejas para exponer un área rectangular amplia de piel para la cirugía.
4. Transfiere el ratón a un instrumento estereotáxico colocando su nariz en el cono de la nariz adjunto y estabilizando el cráneo con barras en las orejas. Mantenga el isoflurano al 5% durante la colocación de las barras auriculares y la parte inferior de la espalda al 2-3% una vez que el mouse esté asegurado en el dispositivo estereotáxico.
5. Administrar medicamentos analgésicos preoperatorios por vía intraperitoneal — Meloxicam (2.0 mg/kg). Aplique generosamente lubricante ocular en los ojos abiertos del ratón para evitar la desecación de la córnea cuando esté bajo anestesia.
6. Coloque el arco de soporte torácico debajo del abdomen del ratón mientras endereza el cuerpo y la columna vertebral del ratón tirando ligeramente de la base de la cola. Use cinta de etiquetado de laboratorio para asegurar la cola y todas las extremidades extendidas en una posición similar a una estrella. Una vez asegurado, empuje el arco de soporte torácico rostralmente, desde el abdomen del ratón hacia la parte superior del tórax, para apoyar la columna torácica (Figura 1B).
7. Prepare un campo quirúrgico estéril desinfectando el área de la piel recortada con pelo preparada en el paso 1.3 con etanol al 70%, seguido de povidona-yodo. Repita dos veces. Aplique un paño quirúrgico estéril para mantener un amplio campo estéril.
8. Usando una hoja de bisturí #10, haga una incisión vertical paralela al eje longitudinal del animal desde el punto medio de ambos omóplatos hasta la curvatura de la columna torácica. Retraiga la piel para exponer los tejidos blandos y el contorno de la columna vertebral (Figura 1C).
9. Identifica el borde inferior de la almohadilla de grasa supraescapular (esto demarca el nivel vertebral T4/5). Con la misma cuchilla #10, con cuidado pero con fuerza, corte a lo largo de ambos lados del hueso vertebral T5-T8/9 para separar los tendones de los músculos de la espalda de la columna.
10. Inserta los dientes de los retractores en los sitios de incisión a ambos lados de la columna. Ajuste la exposición expandiendo los retractores para elevar suficientemente la columna vertebral sin ejercer demasiada presión sobre las capas musculares retraídas (Figura 1D).
11. Bajo el microscopio quirúrgico, limpie cuidadosamente el músculo residual y otros tejidos blandos que recubren la columna vertebral para exponer el hueso vertebral (Figura 1E). Identifique las vértebras que se extirparán sujetando la apófisis espinosa de las vértebras con pinzas dentadas y moviéndola ligeramente hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: Esto debería permitir la identificación de las articulaciones intervertebrales y exponer las pequeñas aberturas (forámenes intervertebrales) debajo de las vértebras de interés.
12. Inserte una cabeza de las tijeras curvas desafiladas en cada lado del agujero intervertebral expuesto, caudal a la lámina vertebral a extirpar, y corte las articulaciones intervertebrales conectadas bilateralmente.
13. Levanta la lámina hacia arriba y corta la unión superior de la lámina para aislar y eliminar el hueso.
    NOTA: Esto expondrá el saco dural intacto que contiene la médula espinal (Figura 1F). Puede haber un sangrado excesivo que se puede controlar colocando una gasa precortada de 1 cm x 1 cm en las áreas afectadas y/o lavando con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
14. Con la vena dorsal de la línea media sirviendo como punto de referencia, inserte un eje doblado de 45° de una punta de aguja de 30 G (con el bisel de la aguja hacia arriba) en la superficie dorsolateral de la médula espinal (aproximadamente 1 mm de profundidad) a aproximadamente 0,5 mm lateral a cada lado de la línea media.
15. Mueve la aguja ~2 mm de caudal a rostral (paralela a la línea media) de modo que toda la longitud del bisel de la aguja quede insertada en el cordón. Retire la aguja volviendo sobre el trazado por la vía de entrada (Figura 1G).
    NOTA: No debería haber sangrado, pero se puede ver hinchazón del tejido espinal en este paso.
16. Para cerrar la herida, retire el retractor y suture los músculos de la espalda a ambos lados de la lesión juntos en la línea media utilizando una sutura absorbible 6-0. Utilice una sutura de seda estéril 4-0 para cerrar posteriormente la piel suprayacente.

Resultados

Figura 1: Procedimiento quirúrgico. (A) La disposición de todo lo requerido, numerada como referencia. (B) Una imagen del ratón en un dispositivo estereotáxico con el cuerpo, la columna vertebral y las extremidades estiradas y pegadas con cinta adhesiva junto con un arco de soporte torácico colocado debajo. (C) Una imagen del ratón con una incisión ve...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agricola Retractor	Fine Science Tools	17005-04
Moria Tijeras de resorte Vannas-Wolff (curvas)	Fine Science Tools	15370-50	Personaliza al hacer el pedido para obtener puntas
Graefe Forceps (Straight, 1x2 Teeth)	Fine Science Tools	11053-10
Pinzas de Graefe Extra Finas (Curvas, Dentadas)	Fine Science Tools	11152-10	O cualquier otra pinza para suturar
Hartman Hemostats (Straight)	Fine Science Tools	13002-10	O cualquier otro apropiado para suturar
Mango de Bisturí #3	Fine Science Tools	10003-12	Or any other appropriate
Hair clippers	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	o cualquier otro apropiado
Instrumento estereotáxico	Stoeling	51500	or any other appropriate
Meloxicam			or cualquier otro apropiado sancionado por el centro
Tears Naturale P.M.	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	or any other appropriate
Isoflurane	Baxter International Inc	DIN 02225875	o cualquier otro apropiado para la anestesia
Hisopos Cottom Swabs	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
Cotton Gauze	Fisher Scientific	13-761-52
30G Needles	Becton Dickinson	305106	For Injury
25G Needles	Becton Dickinson	305122	Para inyecciones
1mL Jeringas	Becton Dickinson	3090659	for drug injections
3mL Syringes	Becton Dickinson	309657	para inyecciones de fluidos
4-0 Suturre	uoftmedstore.com	2297-VS881	for skin suturing
6-0 Suturre	uoftmedstore.com	VS889	for muscle suturing
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection Microscope	Zeiss	Stemi 2000

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