Realización de inmunohistoquímica en tejido cerebral de primates no humanos

Resumen

Fuente: Eid, L. y Parent, M. Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para inmunohistoquímica previa a la inclusión y microscopía electrónica. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra la preparación de tejido cerebral de primates no humanos fijado en aldehído utilizando inmunohistoquímica previa a la inclusión para microscopía electrónica. Describe los pasos para el inmunomarcaje de una proteína neuronal específica, seguido de una reacción de peroxidasa que produce un precipitado coloreado, lo que permite la visualización de la proteína objetivo en microscopía electrónica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Pre-inclusión de inmunohistoquímica (Figura 1C)

1. Prepare una solución madre de 4 L de solución salina tamponada con Tris (TBS, 50 mM, pH 7,6) de la siguiente manera.
   1. Mida 2 litros de agua destilada en un vaso de precipitados de 4 litros, añada 24,23 g de trihidroximetilaminometano (THAM; C₄H₁₁NO₃), y revuelve para disolver.
   2. Ajuste el pH a 7.6 con aproximadamente 148 mL de HCl 1 N. El ácido debe agregarse con precaución para evitar alcanzar un pH inferior a 7,6. El volumen total debe ser de 4 L.
      PRECAUCIÓN: El HCl es altamente corrosivo. Use el EPP adecuado.
2. Seleccione las secciones que contienen la región de interés que se va a procesar para la inmunohistoquímica EM.
3. Lave las secciones flotantes 3 veces en PBS (0,1 M, pH 7,4) durante 5 minutos a RT para enjuagar la solución anticongelante.
4. Prepare una solución al 0,5% de NaBH₄ diluida en PBS.
   1. Pesar 0,05 g de NaBH₄ y diluirlo en 10 mL de PBS. No lo cubra. Prepare esta solución justo antes de usarla.
5. Incubar las secciones en la solución de NaBH recién preparada₄ durante 30 min en RT. Balancee suavemente. No lo cubra.
6. Lavar 3 veces en PBS durante 10 minutos en RT, meciendo vigorosamente hasta que no quede nada del gas de reacción.
7. Prepare una solución de bloqueo para EM con un 2% de suero normal apropiado y un 0,5% de gelatina de pescado fría diluida en PBS.
   NOTA: La cantidad debe calcularse para tener suficiente para los siguientes tres pasos. Utilizar un suero elaborado a partir de la misma especie animal que alberga el anticuerpo secundario. Evite el uso de métodos de recuperación de antígenos o la adición de pequeñas cantidades de tritón (para aumentar la penetración de los anticuerpos), ya que estos métodos comprometen significativamente la calidad del tejido.
8. Incubar las secciones en la solución de bloqueo durante 1 h a RT. Mecer suavemente.
9. Prepare la solución de anticuerpos primarios diluida en la solución de bloqueo.
   NOTA: La concentración del anticuerpo primario suele ser la misma que la de la inmunohistoquímica de LM, pero considere realizar pruebas con diferentes concentraciones de anticuerpos de antemano, ya que algunos anticuerpos primarios pueden no funcionar con la acroleína. Si es así, es posible utilizar una mezcla de glutaraldehído (0,1 - 2%) y PFA al 4% para la perfusión transcardíaca y obtener resultados similares. Optimice también el tiempo y la temperatura de incubación.
10. Incubar las secciones en solución primaria de anticuerpos durante la noche en RT con un balanceo suave. Utilice un tiempo y una temperatura de incubación previamente probados.
11. Lave las secciones 3 veces en PBS durante 5 minutos a RT con un balanceo suave.
12. Prepare una solución 1:1.000 de anticuerpo secundario biotinilado diluido en la solución de bloqueo.
    NOTA: El anticuerpo secundario debe ser levantado contra la especie huésped utilizada para generar el anticuerpo primario.
13. Incubar las secciones en una solución secundaria de anticuerpos durante 1,5 h a RT. Mecer suavemente.
14. Prepare una solución de avidina-biotina-peroxidasa (ABC) al menos 60 minutos antes del final de la incubación secundaria del anticuerpo.
    1. Utilice una pipeta calibrada para medir 8,80 μL/ml de las soluciones A y B y dilúyalas en PBS.
    2. Balancee suavemente durante al menos 60 minutos en RT para permitir la unión completa entre las moléculas de avidina y biotina.
15. Después de la incubación en la solución de anticuerpos secundarios, lavar 3 veces en PBS durante 10 min en RT.
16. Incubar las secciones en la solución ABC durante 1 h en RT. Meca suavemente.
17. Lavar una vez en PBS y dos veces en TBS durante 10 min en RT con un balanceo suave.
18. Prepare una solución fresca de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) al 0,05% con H₂O₂ diluido en TBS.
    1. Pesar 12,5 mg de DAB y diluirlo en 25 mL de TBS frío. Proteger de la luz.
       PRECAUCIÓN: El polvo DAB es altamente volátil y dañino si se inhala. Es cancerígeno y teratogénico. Por lo tanto, las mujeres embarazadas o en período de lactancia no deben manipular este producto, incluso cuando está diluido. Use una mascarilla N95 cuando manipule y use EPP.
    2. Filtre la solución y agregue 4,5 μL de 30% H₂O₂ justo antes de usar.
19. Incubar las secciones en la solución DAB durante 3 a 7 min en RT. Meca suavemente.
    NOTA: El precipitado marrón no debe ser demasiado oscuro para evitar un alto nivel de manchas de fondo. El tiempo de incubación debe optimizarse en consecuencia.
20. Detenga la reacción lavando rápidamente dos veces en TBS frío, luego dos veces durante 10 min en TBS frío en RT, seguidas de dos veces durante 10 min en PB, con balanceo leve.
    NOTA: El uso de PB (y no PBS) es crítico para eliminar cualquier rastro de NaCl, ya que reaccionaría con el osmio y formaría cristales.

Resultados

Figura 1: Esquemas de los pasos esenciales del protocolo. El cerebro de mono (A) se corta en secciones seriadas con un vibratomo de enfriamiento (B). A continuac...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fosfato de sodio anhidro dibásico	Fisher scientific	S374-500
Monobásico monohidrato de fosfato de sodio	EM Science	SX0710-1
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N dilution. El producto es corrosivo. Úselo con la potencia adecuada.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N dilution. El producto es corrosivo. Úselo con la protección adecuada.
Paraformaldehyde<	P6148	4% dilution. El producto es altamente volátil en su forma de polvo y altamente tóxico. Úselo con precaución debajo de una campana de ventilación con la protección adecuada.
Acrolein (90%)	sigma	110221	3% dilution. El producto es altamente tóxico. Úselo debajo de una campana de ventilación con la protección adecuada.
Autopsy venting table	Mopec	CE400
Electronic perfusion pump	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine			20 mg/kg<
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg<
Scalpel
Scalpel blades	Feather lance	201011 J9913	No.22 para cirugía y No. 11 para EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	Calibra la cuchilla antes de cada uso, cuando el dispositivo lo permita
Vibratome razor blade	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% de dilución
Ethylene glycol	Fisher scientific	E178-4	30% dilution
Sodium borohydride	sigma	S-9125
Normal horse serum	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2% dilution
Gelatina de pescado frío	Aurion	900.033	0,5% de dilución. El producto original se concentra al 40%
Primary antibody, SERT	Santa Cruz biotechnology	SC-1458	1/500 dilution
Antibody primario, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 dilution
Primary antibody, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
Anticuerpo secundario biotinilado, cabra	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 dilution
Anticuerpo secundario biotinilado, mouse	Laboratorios vectoriales	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Laboratorios vectoriales	PK6100	8.8 μL/mL de A y B cada uno
3'3 diaminobenzidina (DAB)	Sigma	D5637	0,05% dilution. El producto es altamente volátil en su forma de polvo y tóxico. No tires los residuos en el fregadero.
Peroxide 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% dilution

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