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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
- Tinción de tejidos
- En una caja de tinción hermética a la luz, cree una "cámara de humedad" con pañuelos sin pelusa empapados con agua desionizada.
- Seque los bordes del portaobjetos con un pañuelo sin pelusa, use un mini bolígrafo para hacer un borde repelente a líquidos en el borde del portaobjetos, lejos de las secciones de pañuelos. Este borde debe asegurar un amplio espacio entre el menisco del líquido y el borde del tejido para que la tensión superficial no afecte a la tinción.
NOTA: El borde repelente de la pluma de Papanicolaou se puede aplicar antes de 1.1.3 si los anticuerpos de interés no requieren recuperación de antígeno por microondas. Si el bolígrafo para papanicolaou se ha aplicado antes del lavado en PBS, se debe verificar la integridad del borde repelente a líquidos en este paso. Usa un bolígrafo mini para rellenar los espacios en el borde. - Con portaobjetos colocados horizontalmente, bloquee la unión de antígenos inespecíficos incubando en suero v/v al 4% en PBS (solución de bloques). Pipetear 300 μl de solución en bloque por portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente. Asegúrese de que la solución de bloqueo se extienda hasta la pluma de Papanicolaou en el borde del portaobjetos y cubra completamente el tejido para evitar manchas desiguales causadas por la tensión superficial cerca del tejido.
- Use suero de la misma especie en la que se produce el anticuerpo secundario. Nota: En este procedimiento, los anticuerpos secundarios se producen en burro y, por lo tanto, se utiliza suero de burro. Si se utilizan anticuerpos secundarios de dos o más especies diferentes, se debe incluir suero de cada especie.
- Pipetear el anticuerpo primario en portaobjetos. Nota: Las concentraciones de anticuerpos para esta tinción se han optimizado a 1:5.000 y 1:500 para Iba1 y Pan-neuronal, respectivamente. Se ha encontrado que estas concentraciones muestran una tinción significativa sin tinción de fondo.
- Diluir la solución en bloque al 1% de suero en PBS y añadir anticuerpos primarios. Pipetear 300 μl de solución de anticuerpos primarios en suero al 1% por portaobjetos. Nuevamente, asegúrese de que el líquido esté en el borde de la pluma de Papanicolaou. Incubar durante la noche a 4 °C.
- Incluya tres portaobjetos de control: uno que no contenga ni Iba1 ni anticuerpos panneuronales, uno con Iba1 sin anticuerpo panneuronal y otro con anticuerpo panneuronal sin Iba1. Tiña estos portaobjetos en la misma corrida con las mismas soluciones, sin embargo, omite los anticuerpos primarios para probar la unión inespecífica de los anticuerpos secundarios.
- A la mañana siguiente, lave los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 minutos cada uno, cambiando la solución entre lavados.
- Los anticuerpos fluorescentes son sensibles a la luz, por lo tanto, a partir de este paso, minimice la exposición a la luz asegurándose de que los recipientes de lavado estén envueltos en papel de aluminio y que las cajas de hibridación estén negras o incubadas en la oscuridad. Pipetear los anticuerpos secundarios apropiados en todos los portaobjetos e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente a una concentración de 1:250 en solución en bloque (ver paso 1.2.3) en una "cámara de humedad" hermética a la luz (ver paso 1.2.1).
- Utilizar anticuerpos secundarios de diferentes longitudes de onda. En este caso, para el anticuerpo primario anti-Iba1 para conejos, utilice el anticuerpo anti-conejo 594 como anticuerpo secundario adecuado. Para el anticuerpo primario anti-pan-neuronal de ratón, use burro anti-ratón 488 como anticuerpo secundario apropiado. Alternativamente, use anti-conejo 488 y anti-ratón 594.
- Lave los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 minutos cada uno.
- Opcional: realizar la tinción nuclear.
- Colocar en Hoechst (u otra tinción nuclear) a una concentración de 0,03 μg/ml en H2O durante exactamente 60 segundos.
- Lave los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 minutos cada uno.
- Lavar en ddH2O.
- Coverslipping
- Portaobjetos de cubreobjetos con un medio de montaje acuoso, como Fluoromount-G o ProlongGold. Tenga cuidado de eliminar todas las burbujas con un aplicador con punta de algodón.
Nota: Se podrían usar otros agentes de montaje, sin embargo, algunos han notado un alto sangrado entre tintes a los pocos días de cubrirse. - Usa esmalte de uñas transparente para sellar los bordes, evitando que las secciones se sequen debido a la evaporación. Deje que el esmalte de uñas se seque en un recipiente hermético a la luz mientras los portaobjetos permanecen planos y a temperatura ambiente, y luego guárdelo en un recipiente hermético a la luz envuelto en papel de aluminio a 4 °C.