Tinción inmunohistoquímica de biomarcadores en secciones de la neurosfera de tumores cerebrales

Resumen

Fuente: Núñez, F. J., et al. Evaluación de biomarcadores en glioma por inmunohistoquímica en cultivos de neurosfera de glioma 3D embebidos en parafina. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra una técnica inmunohistoquímica para marcar biomarcadores tumorales en neuroesferas tumorales cerebrales incluidas en parafina. Las secciones de la neurosfera se someten a una eliminación de parafina y rehidratación, seguida de un tratamiento para exponer los sitios de biomarcadores. A continuación, se aplican anticuerpos primarios y secundarios para marcar estos biomarcadores. Los anticuerpos secundarios se unen a enzimas peroxidasas conjugadas con avidina, que oxidan los sustratos cromogénicos para indicar la ubicación de los biomarcadores. Por último, se completan la contratinción nuclear y la preparación de portaobjetos para el análisis microscópico.

Protocolo

1. Inmunohistoquímica (IHQ) de neurosferas (NS) incluidas en parafina

1. Derrita la parafina colocando los portaobjetos en una rejilla metálica e incubándolos a 60 °C durante 20 min.
2. Desparafinar los portaobjetos mediante incubación en un tren de rehidratación a temperatura ambiente (RT): 3x xileno durante 5 min, 100% 2x etanol durante 2 min, 95% 2x etanol durante 2 min, 70% 1x etanol durante 2 min, y 1x agua desionizada durante 2 min. A partir de ahora, mantenga los portaobjetos en agua del grifo hasta la extracción del antígeno, ya que el secado provocará una unión de anticuerpos inespecíficos.
3. Incubar los portaobjetos en tampón de citrato (10 mM de ácido cítrico, detergente no iónico al 0,05%, pH 6) a 125 °C durante 30 s y a 90 °C durante 10 s. Deje que se enfríen, luego enjuague los portaobjetos 5 veces con agua destilada.
4. Incubar los portaobjetos en RT al 0,3% H₂O₂ durante 30 min.
5. Lave los portaobjetos 3 veces en tampón de lavado (detergente al 0,025% en solución salina tamponada con Tris [TBS]) durante 5 min con agitación suave.
6. Incubar los portaobjetos en RT con solución bloqueante (10% de suero de caballo, 0,1% de albúmina sérica bovina [BSA] en TBS) durante 30 min.
7. Incubar los portaobjetos durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada con anticuerpo primario preparado en solución de dilución (0,1% BSA en TBS). Lave los portaobjetos 3 veces en el tampón de lavado durante 5 minutos con una agitación suave.
8. Incubar los portaobjetos en RT durante 1 h con un anticuerpo secundario biotinilado preparado en solución de dilución. Lave los portaobjetos 3 veces en el tampón de lavado durante 5 minutos con una agitación suave.
9. Incubar los portaobjetos en RT en la oscuridad durante 30 min con el complejo de peroxidasa de rábano picante avidina-biotinilado. Lave los portaobjetos 3 veces en el tampón de lavado durante 5 minutos con una agitación suave.
10. Incube los portaobjetos con 3,3′-Diaminobenzidina (DAB)-H₂O₂ marcas de sustrato aquí durante 2-5 min en RT.
11. Enjuague 3 veces con agua del grifo. Sumerja (1-2 s) los portaobjetos en una solución de hematoxilina para contrateñirlos, luego enjuáguelos bien con agua del grifo hasta que estén claros.
12. Deshidratar los portaobjetos de la siguiente manera: incubar en agua destilada durante 2 minutos, sumergir 3 veces en etanol al 80%, incubar en etanol al 95% 2 veces durante 2 minutos cada una, incubar en etanol al 100% 2 veces durante 2 minutos cada una, y finalmente en xileno 3 veces durante 3 minutos cada una.
13. Cubra los portaobjetos con un medio de montaje a base de xileno y déjelos secar sobre una superficie plana en RT hasta que estén listos para la obtención de imágenes.

NOTA: Si se realiza la tinción de DAB, los portaobjetos se pueden almacenar en RT. Sin embargo, si se realiza la tinción con inmunofluorescencia, los portaobjetos deben almacenarse en la oscuridad a -20 °C para reducir el fotoblanqueo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-ATRX policlonal de conejo,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilución
Conejo policlonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, dilución 1:1000
Conejo policlonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHQ, dilución 1:500
Cabra policlonal anti-conejo conjugada con biotina	Dako	E0432	IHC, 1:Dilución 1000
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT{{TAG_ 61}}	Biocare medical	BDB2004 L/precio hasta 12/18