Análisis ultraestructural de una sección del cerebro de un ratón mediante microscopía electrónica de transmisión

Abstract

Fuente: Lutz, D., et.al. Evaluación de los parámetros de neuroplasticidad ultraestructural después de la transducción en el útero del cerebro y la médula espinal del ratón en desarrollo. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra la preparación y el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de una sección del cerebro de un cachorro de ratón. El protocolo comienza con tejido fijado en tetróxido de osmio incrustado en resina, seguido de un recorte preciso para aislar la región de interés y ultramicrotomía para producir secciones semifinas y ultrafinas, que se visualizan mediante microscopía óptica y TEM, respectivamente.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Selección de parámetros de neuroplasticidad ultraestructural para análisis cuantitativo

1. Mapeo del área de interés
   1. Elija un área de interés (por ejemplo, hipocampo o cerebelo) y localice el área en el atlas de la sección eligiendo la imagen del atlas que contiene esta área.
   2. Dibuje los bordes del área de interés en la imagen de la sección y encuentre/superponga estos bordes de la región en el espécimen de resina.
   3. Marque los bordes del área de interés (por ejemplo, hipocampo o cerebelo) en la muestra de resina, utilizando un calibre de aguja fina (26 G, 1 pulgada).
   4. Caliente la muestra de resina a 85 °C en un horno para ablandar la resina para recortarla o, alternativamente, use un dispositivo de recorte, una cuchilla delgada o papel de lija.
   5. Extirpa el área de interés del espécimen de resina con una cuchilla de afeitar. Monte la muestra en barras de sujeción de vidrio acrílico del calibre requerido (por ejemplo, con un diámetro de 8 mm y una longitud de 1 cm) con pegamento. Recorte la muestra montada para un corte semifino y ultrafino.
   6. Prepare secciones semifinas (0,75 μm) y ultrafinas (70 nm) de la zona recortada con un ultramicrótomo: ajústelo a 1,5 mm/s para un grosor de 0,75 μm y a 0,7 mm/s para un grosor de 70 nm.
   7. Recoja las secciones semifinas en soportes de vidrio y tiña las secciones con azul de toluidina al 1% en PBS (durante 4 min).
   8. Lave las secciones varias veces con agua desionizada. Examine las secciones teñidas bajo el microscopio óptico utilizando objetivos 4x (NA de 0,1 ∞/-), 10x (NA de 0,22 ∞/0,17), 40x (NA de 0,65 ∞/0,17) y 100x (NA de 1,25 ∞/0,17).
   9. Recoja secciones ultrafinas en rejillas de níquel. Someta las rejillas a TEM a 180 kV y con aumentos de 3.200x, 6.000x y/o 8.000x.
2. Análisis TEM
   1. Elija los parámetros ultraestructurales de interés para el análisis cuantitativo de TEM (por ejemplo, botones con vesículas y mitocondrias o axones mielinizados y no mielinizados) y tome imágenes TEM de estos parámetros con un aumento de 3.500x, 6.000x y/o 8.000x.

Materials