Imágenes microscópicas electrónicas de transmisión de la endocitosis de vesículas sinápticas en neuronas del hipocampo de ratón

Resumen

Fuente: Villarreal, S., et. al., Medición de la endocitosis de vesículas sinápticas en neuronas del hipocampo cultivadas. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra el análisis de la endocitosis de vesículas sinápticas en neuronas del hipocampo cultivadas mediante marcaje de peroxidasa de rábano picante y microscopía electrónica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

Microscopía electrónica

1. Prepare una solución de estimulación con alto contenido de K⁺ con HRP (peroxidasa de rábano picante) como 31,5 mM de NaCl, 2 mM de CaCl₂, 90 mM de KCl, 25 mM de HEPES (pH 7,4), 30 mM de glucosa, 2 mM de MgCl₂, 0,01 mM de CNQX, 0,05 mM de AP5 y 5 mg/mL de HRP, luego ajuste a pH 7,4 con 5 M de NaOH.
   1. Estimular el cultivo de neuronas del hipocampo con una solución de estimulación a temperatura ambiente de 1,5 mL de K⁺ (denominada K⁺) mediante la adición de 1,5 mL a cada pocillo durante 90 s. En la condición de reposo (denominada R), aplique la misma concentración de 5 mg/mL HRP durante 90 s, pero con solución salina normal. Para la muestra de recuperación, aplique una solución de estimulación con alto contenido de K⁺ como con la muestra de K⁺, luego lavar rápidamente y reemplazar con solución salina normal e incubar durante 10 min.
2. Fijación y tinción
   
   1. Prepare un tampón de cacodilato de Na de 0,1 M utilizando 21,4 g/L de cacodilato de Na a pH 7,4. Fije las células con glutaraldehído al 4% en tampón de cacodilato de Na de 0,1 M durante al menos 1 h a temperatura ambiente. Lavar tres veces con tampón de cacodilato 0,1 M Na durante 7 min cada una.
   2. Prepare la solución de diaminobenzidina (DAB), compuesta por 0,5 mg/mL de DAB con 0,3% de H₂O₂ en ddH₂O, y filtre con un filtro de 0,22 μm. Aplicar 1,5 mL de solución DAB durante 30 min a 37 °C. Lavar tres veces con tampón de cacodilato de Na 0,1 M durante 7 min cada una.
      PRECAUCIÓN: El DAB es un tóxico y se sospecha que es cancerígeno. Utilice guantes y batas de laboratorio.
      NOTA: El etiquetado con DAB se produce debido a su oxidación por H₂O₂, catalizado por HRP. Pequeños aumentos en los componentes dan como resultado un aumento de la señal en la muestra. El aumento de la concentración de HRP acelera el efecto del catalizador. Concentraciones suficientemente grandes de H₂O₂ permiten reacciones secundarias debilitantes con HRP, inhibiendo el efecto del marcaje³². En este trabajo, las concentraciones de este sistema de etiquetado se eligieron con base en la investigación disponible actualmente.
   3. Incubar las neuronas con 1,5 mL de OsO₄ en tampón de cacodilato de Na de 0,1 M durante 1 h a 4 °C como postfijación. Lavar tres veces con 1,5 mL de tampón cacodilato de 0,1 M Na durante 7 min cada una.
      PRECAUCIÓN: Debido a la toxicidad y reactividad del OsO₄, mantener la muestra en hielo en una campana química es preferible en muchos casos a usar un refrigerador para la incubación.
   4. Prepare tampón de acetato de sodio 0,1 M con 13,61 g/L de acetato de sodio y 11,43 mL/L de ácido acético glacial a pH 5,0. Lavar tres veces con 1,5 mL de tampón de acetato 0,1 M a pH 5,0 durante 7 min cada una e incubar con 1,5 mL de acetato de uranilo al 1% en tampón de acetato 0,1 M a pH 5,0 durante 1 h a 4 °C. Lavar tres veces con 1,5 mL de tampón de acetato 0,1 M durante 7 min cada una.
      
3. Incrustación epoxi
   
   1. Deshidrate el cultivo de neuronas con lavados individuales de 1,5 mL de etanol al 50%, 70% y 90%, durante 7 minutos en cada uno y luego 3 lavados de 1,5 mL de etanol al 100% durante 7 min cada uno en una campana extractora.
   2. Mezcle 485 mL/L de resina epoxi de bisfenol-A-(epiclorhidrina), 160 mL/L de anhídrido succínico dodecenil (DDSA), 340 mL/L de metil-5-norborneno-2,3-anhídrido dicarboxílico (NMA) y 15 mL/L de 2,4,6-tris(dimetilaminometil)fenol (DMP-30) para crear la resina epoxi. Mezcle bien, luego guárdelo al vacío para eliminar las burbujas de aire.
      NOTA: Es fundamental eliminar las burbujas de aire en la resina, especialmente aquellas más pequeñas de lo que se ve a simple vista, porque pueden causar cavidades en la resina durante el corte.
   3. Infiltre la muestra reemplazando el etanol con resina epoxi al 50% en etanol durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador, luego resina epoxi al 70% en etanol durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador.
   4. Cambiar la solución de resina epoxi por resina epoxi 100% e incubar durante 10 min a 50 °C. Realizar dos intercambios de resina epoxi 100% fresca con incubaciones durante 1 h a 50 °C. Añadir resina epoxi 100% fresca y dejar endurecer a 50 °C durante la noche y luego a 60 °C durante más de 36 h para que se endurezca.
4. Retire cada muestra de la placa de pocillos múltiples con una sierra de mano de joyero. Seleccione regiones de interés, concentraciones densas de células, utilizando un microscopio de luz invertida, y luego corte bloques de 70 a 80 nm para seccionarlos con micrótomo. Monte la región de corte en el mandril del micrótomo y cargue el micrótomo. Coloque el mandril en el micrótomo y monte un cuchillo de diamante con el borde paralelo a la superficie del bloque. Recoja secciones de 70 a 80 nm de espesor directamente en cuadrículas individuales.
5. Disuelva el acetato de uranilo en agua para obtener una solución al 1% en peso, y disuelva por separado el citrato de plomo en agua para obtener una solución al 3% en peso. Contratinción de las secciones por inmersión con acetato de uranilo acuoso al 1% durante 15 min y luego citrato acuoso de plomo al 3% durante 5 min para mejorar el contraste de las muestras.
6. Imágenes EM
   1. Examine las secciones con un microscopio electrónico de transmisión y grabe imágenes con una cámara digital CCD con un aumento primario de 10.000-20.000X.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103-049	Growth media for neuron, Warm up to 37°C before use
B27	Thermo Fisher	17504-044	Gradiente para la diferenciación neuronal
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	Gradient for neuronal culture
Tripsina XI del páncreas bovino	Sigma	T1005	Neuronal culture-digest hippocampal tissues
Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino	Sigma	D5025	Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension
Poly-l-lysine	Sigma	P4832	Microscopía electrónica, sustrato para el crecimiento neuronal, aplicar en una placa multipocillo durante 1 h a temperatura ambiente y luego lavar con agua esterilizada 3 veces
Horseradish peroxidasa (HRP)	Sigma	P6782	Microscopía electrónica, marcaje de vesículas sinápticas endocitadas mediante la catalización de DAB en presencia de peróxido de hidrógeno, la concentración final es de 5 mg/mL en solución salina normal, refrescar antes de usar
Cacodilato de sodio	Electron Microscopy Sciences	12300	Microscopía electrónica, tampón para fijadores y lavado, la concentración final es 0.1 N
3,3′-Diaminobenzidina (DAB)	Sigma	D8001	Microscopía electrónica, marcaje de vesículas sinápticas endocitadas, sustrato para HRP, concentración final es de 0.5 mg/mL en DDW y filtrado, hacer fresco antes de usar
Hydrogen solución de peróxido	Sigma	H1009	Microscopía electrónica, marcaje de vesículas sinápticas endocitosadas mediante la inducción de la reacción HRP-DAB, la concentración final es del 0,3% en DDW, hacer fresco antes de usar
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16365	Microscopía electrónica, fijadores, la concentración final es del 4% en tampón de Na-cacodilato, refrescar antes de usar, agitar bien antes de usar
TEM	JEOL	200CX	Microscopía electrónica, imágenes de vesículas endocitosadas y cambios
CCD digital camera	AMT	XR-100	Microscopía electrónica, capturando imágenes
Lead citrate	Leica microsystems	16707235	Microscopía electrónica, tinción de rejilla

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